白屈菜-元胡药对逆转乳腺癌阿霉素耐药药效物质研究

邹 翔，张雪瑞，于佳慧，孙雨恒，张宇航，舒 淇，曲中原*

1.哈尔滨商业大学 药物工程技术研究中心，黑龙江 哈尔滨 150076

2.哈尔滨商业大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150076

据美国癌症协会最新统计，乳腺癌在女性癌症发生率中居于首位[1]。临床上，乳腺癌的治疗常以手术为主，同时结合新辅助化疗、内分泌治疗和靶向治疗[2]。蒽环类药物如阿霉素通常与环磷酰胺和氟尿嘧啶等药物联合应用于新辅助化疗方案，该方案对于III 期乳腺癌患者是一个有潜力的治疗方案[3]。然而，部分肿瘤患者会对阿霉素产生耐药性，极大地制约了癌症治疗效果，而其耐药的主要机制包括P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）等跨膜蛋白介导的耐药、药物代谢酶的异常表达、DNA 损伤修复机制以及发生上皮细胞向间充质细胞转化等[4]。因此，新型耐药逆转剂的筛选与研发仍是解决乳腺癌新辅助化疗耐药的主要问题。

白屈菜-元胡药对（ChelidoniiHerba-Corydalis Rhizomadrug pair，CMCR）是中医临床用于治疗肿瘤的药对之一[5-6]。白屈菜是罂粟科植物白屈菜ChelidoniummajusL.的干燥全草，具有抗炎、镇痛、止咳平喘的功效[7]。元胡又称延胡索，为罂粟科植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang 的干燥块茎，主要有活血化瘀、行气止痛之功效[8]。近年来研究表明，白屈菜生物碱对多种癌细胞（如人非小细胞肺癌A549 细胞、人结肠癌HCT116、SW480 细胞、人乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7 细胞）表现出细胞毒作用[9]，并能通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路来促使人乳腺癌阿霉素耐药细胞（MCF-7/ADR）恢复对阿霉素的敏感性[10]。而元胡中生物碱可抑制人肝癌HepG2 细胞、HCT116 细胞、A549 细胞和人白血病HL60 细胞体外增殖[11]，并具有抑制乳腺癌细胞中P-gp 活性的能力，逆转MCF-7/ADR 细胞对阿霉素的抗性[12]。此外，课题组前期研究也发现，CMCR 可通过下调雌激素受体α（estrogen receptor α，ERα）、p-PI3K、p-Akt 蛋白的表达水平和雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）mRNA 的表达水平，有效抑制ER 阳性乳腺癌细胞的增殖[5]。提示CMCR 具有良好的抗肿瘤作用和潜在的逆转肿瘤细胞耐药的作用，但其逆转肿瘤化疗耐药的药效尚需研究验证，相应的药效物质基础研究也尚未系统开展。因此，本研究采用体外耐药细胞模型对CMCR 各提取部位逆转耐药的药效进行评价。同时，采用UPLC-Q-TOF-MS 技术分析不同配伍比例和不同提取部位下CMCR 的共有成分，筛选CMCR逆转耐药作用的药效物质，进一步对CMCR 主要药效物质组逆转乳腺癌阿霉素耐药的机制进行探究，为其在肿瘤化疗耐药方面的临床应用提供指导，同时也为相关化疗耐药逆转剂的研发提供科学依据。

1 材料

1.1 细胞

MCF-7/ADR 细胞由哈尔滨商业大学药物工程技术研究中心提供。

1.2 药材

白屈菜、元胡（醋）饮片均购自哈尔滨市汇仁药材站，经哈尔滨商业大学药学院曲中原教授分别鉴定为罂粟科植物白屈菜C.majusL.的干燥全草和罂粟科植物延胡索C.yanhusuoW.T.Wang 的干燥块茎。

1.3 药品与试剂

对照品白屈菜碱、延胡索乙素、二氢血根碱、白屈菜红碱（批号分别为 DST220428-079、DSTDY010101、DST220726-042、DST201109-040，质量分数≥98%）均购自成都德思特生物技术有限公司；阿霉素（批号N1111B，质量分数≥98%）、RPMI 1640 培养液购自大连美仑生物技术有限公司；罗丹明123（批号052621221101）、BCA 试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；胎牛血清购自美国 Gibco 公司；CCK-8 试剂盒（批号K101828133EF5E）购自美国APExBIO 公司；兔抗乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistant protein，BCRP）、肺耐药蛋白（lung resistance protein，LRP）、P-gp 多克隆抗体（批号分别为 M05253192、G07143520、M05262395）均购自沈阳万类生物科技有限公司；HRP 标记的山羊抗兔IgG 二抗（批号BJ08079044）购自北京博奥森生物技术有限公司；兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗体（批号3507442021）购自武汉ABclonal 生物公司；PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA eraser 试剂盒（批号RR047A）、TB GreenTMPremix Ex TaqTM试剂盒（批号RR420A）均购自宝日医生物技术（北京）有限公司；甲醇、乙腈、甲酸等其他试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

1.4 仪器

超高效液相色谱-G6500 系列四极杆-飞行时间质谱联用仪（美国Agilent 公司）；CO-150 型二氧化碳培养箱（美国NBS 公司）；iMark 型酶标仪［伯乐生命医学产品（上海）有限公司］；DYCZ-24DN 型电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；ImageQuant LAS500 型分子生物成像仪（GE 通用电器医疗集团生命科学部）；Easy Cycler 96 型PCR 仪（德国Biometra 公司）；QuantStudioTM1 型实时荧光定量PCR 仪［英潍捷基（上海）贸易有限公司］。

2 方法

2.1 CMCR 各提取部位化学成分表征

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取白屈菜碱、延胡索乙素、二氢血根碱、白屈菜红碱对照品各1.0 mg，分别加入甲醇进行超声溶解，定容至5 mL 量瓶中，制成质量浓度均为0.2 mg/mL 的对照品溶液，经0.22 μm 微孔滤膜滤过，备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 按1∶1 比例称取白屈菜、元胡粉末6、6 g，按2∶1 比例称取白屈菜、元胡粉末8、4 g，分别加10 倍量95%、80%、70%、60%、50%乙醇超声提取2 次，每次1 h；合并滤液，浓缩，得浸膏。加甲醇复溶，制成质量浓度为0.08 g/mL（以浸膏量计）的供试品溶液，经0.22 μm 微孔滤膜滤过，备用。

2.1.3 色谱条件 Acquity UPLC HSS T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～4 min，20%B；4～17 min，20%～22% B；17～19 min，22%～100% B；19～24 min，100%～15% B；体积流量为0.3 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为0.2 μL；检测波长为269 nm[13]。

2.1.4 质谱条件 电喷雾离子源（electron spray ionization，ESI），正离子模式下的离子源电压为4 500 V，离子源温度为550 ℃。正离子模式下的碰撞能量为35 eV；雾化气（gas1）压力为379.225 kPa，辅助气（gas2）压力为34.475 kPa，气帘气（curtain gas）压力为241.325 kPa。一级质谱母离子扫描范围为m/z80～1 500；对信息依赖响应值超过100 cps的8 个最高峰进行二级质谱扫描，子离子扫描范围为m/z50～1 500[14]。

2.1.5 样品检测与数据处理 收集中国知网（CNKI）、PubMed 和ChemSpider 等数据库中白屈菜和元胡的化学成分信息，建立数据库。运用Agilent MassHunter Workstation 工作站软件，以峰强度、保留时间（tR）和质谱数据对各色谱峰进行识别，计算测定化合物相对分子质量与理论值之间的误差，筛选误差小于1×10−5的化合物。根据化合物结构特征分析化合物裂解规律，与二级质谱图进行对照，确定各化合物结构。关键化合物采用对照品或对照品谱图对比进行进一步验证。

2.2 CMCR 逆转MCF-7/ADR 的耐药作用

将对数生长期的MCF-7/ADR 细胞以3.5×104个/mL 接种至96 孔板，每孔100 µL，培养箱中过夜。设置对照组，不同浓度（2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L）阿霉素组，不同质量浓度（0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0、2.000 0 mg/mL）的CMCR 组，阿霉素（2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L）联合CMCR 各提取部位组[各提取部位的20%抑制浓度（20% inhibitory concentration，IC20）]，每孔加入100 µL 药液，对照组加入不含药物的培养基，另设置不接种细胞的空白孔，每组设置6 个复孔。给药72 h 后，每孔加入10 µL CCK-8工作液，微量振荡器上混匀3～5 min，采用酶标仪测定490 nm 处的吸光度（A）值，计算细胞增殖抑制率和耐药逆转倍数。

细胞增殖抑制率＝(A对照－A给药)/(A对照－A空白)

耐药逆转倍数＝药物IC50（不含逆转剂）/药物IC50（含逆转剂）

2.3 共有成分峰面积与药效指标相关性分析

2.3.1 Pearson 相关系数（Pearson correlation coefficient，PCC） 将均值化后的药效物质的峰面积和药效实验中的逆转耐药倍数设为“变量”，采用SPSS 21.0 软件中的双变量相关分析法，计算PCC，各变量之间的系数绝对值越大，表明其线性相关性越强。据此，寻找与逆转耐药作用相关性较大的药效物质。

2.3.2 灰色关联度分析 （grey relational analysis，GRA） 以共有峰（峰面积）为子序列，以药效实验中的逆转耐药倍数为母序列，原始数据采用均值化法处理，利用DPS 数据分析系统进行分析，将子序列与相同母序列的关联度，按从大小排序作为关联序，可直接反映各子序列对母序列的“贡献”程度，从而寻找与逆转耐药作用联系较大的药效物质。

2.3.3 偏最小二乘回归（partial least squares，PLS）分析 将CMCR 不同提取部位共有成分峰面积和逆转耐药倍数的实验结果导入SIMCA-P 14.1 软件，将峰面积设为X变量，药效指标设为Y变量，进行PLS 分析。

2.4 荧光显微镜检测MCF-7/ADR 细胞内罗丹明123 的含量

取对数生长期的MCF-7/ADR 细胞，以2.5×105个/mL 接种于6 孔板中，2 mL/孔，于培养箱中培养24 h。设置对照组、阿霉素（6 µmol/L）组、低剂量白屈菜碱（3 µmol/L）-延胡索乙素（5 µmol/L）组、高剂量白屈菜碱（6 µmol/L）-延胡索乙素（10µmol/L）组、低剂量白屈菜碱（3 µmol/L）-延胡索乙素（5 µmol/L）联合阿霉素（6 µmol/L）组和高剂量白屈菜碱（6 µmol/L）-延胡索乙素（10 µmol/L）联合阿霉素（6 µmol/L）组，给予相应药物后，继续培养48 h，弃去上清液，PBS 清洗细胞2 次，加入5 μg/mL 罗丹明123，室温避光孵育30 min。弃去上清液，用预冷的PBS 洗涤细胞2 次，荧光显微镜下观察细胞内罗丹明123 含量（激发波长488 nm，发射波长525 nm）。使用Image J 软件对荧光强度进行定量分析。

2.5 CCK-8 法确定白屈菜碱和延胡索乙素配伍比例及二者联合用药分析

将对数生长期的MCF-7/ADR 细胞以3.5×104个/mL 接种至96 孔板，每孔100 µL，于培养箱中培养24 h。白屈菜碱给药组浓度为2.5、5、10、20、40、80 μmol/L，延胡索乙素给药组浓度为2.5、5、10、20、40、80 μmol/L，按“2.2”项下方法检测。将白屈菜碱和延胡索乙素的各组细胞增殖抑制率数据输入Synergy Finder 网站进行联合用药分析，利用ZIP（零相互作用效力模型）系统地评估2 药联合应用引发的平均过量反应，预测可能出现的各种形式，ZIP 评分若＞10，说明2 药联合发生的反应超出了单药作用时预期反应的10%，表明2 种药物可能存在协同相互作用；ZIP 评分若为−10～10，表明2 种药物的反应是加和相互作用；ZIP 评分若＜−10，表明2 种药物可能存在拮抗相互作用[15]。

2.6 分子对接技术

从PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载白屈菜碱和延胡索乙素的2D 结构，利用Chemdraw 3D 转为.mol2 格式。从RCSB 数据库（https://www.rcsb.org/）获得靶蛋白的晶体结构，使用AutoDockTools 1.5.6 将配体和受体文件转换为pdbqt 格式，并通过去水及加氢处理来改进其结构。最后，在Discovery Studio 软件（4.5.0 版本）中进行分子对接模拟。

2.7 Western blotting 测定MCF-7/ADR 细胞内耐药相关蛋白的表达

取对数生长期的MCF-7/ADR 细胞，以2.5×105个/mL 接种于6 孔板中，2 mL/孔，于培养箱中培养24 h。按“2.4”项下方法进行分组和给药，继续培养48 h 后收集各组细胞，用RIPA 裂解缓冲液冰浴裂解，离心后收集蛋白。BCA 法进行蛋白定量，蛋白高温变性。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF 膜，于5%脱脂牛奶中室温封闭2 h，分别加入BCRP、LRP、P-gp、GAPDH一抗（稀释比例均为1 ∶1 000），4 ℃孵育过夜；1%TBST 洗膜后，加入HRP 标记的山羊抗兔IgG 二抗（稀释比例为1 ∶1 500），室温孵育2 h。利用ECL发光液显色，采用凝胶成像仪曝光成像，应用Image J 软件分析条带灰度值。

2.8 qRT-PCR 检测MCF-7/ADR 细胞内耐药相关基因的表达

取对数生长期的MCF-7/ADR 细胞，以2.5×105个/mL 接种于6 孔板中，2 mL/孔，于培养箱中培养24 h。按“2.4”项下方法进行分组和给药，培养48 h后，收集各组细胞，Trizol 法提取细胞总RNA，测定RNA 浓度及纯度后按照试剂盒说明书进行逆转录反应得到cDNA。以cDNA 为模板，进行PCR 扩增。扩增条件为95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共40 个循环。以GAPDH 为内参，采用 2−ΔΔCt法计算多药耐药蛋白 1（multidrug resistance 1，MDR1）、乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistant protein，ABCG2）、LRPmRNA 的相对表达量。引物序列：MDR1上游引物 5’-TTGCTGCTTACATTCAGGTTTCA-3’，下游引物5’-AGCCTATCTCCTGTCGCATTA-3’；ABCG2上游引物5’-ACGAACGGATTAACAGGGTCA-3’，下游引物5’-CTCCAGACACACCACGGAT-3’；LRP上游引物5’-AGCCAGCTATGCACCAACAC-3’，下游引物5’-CCTTGCAGGAGCGGTTATC-3’；GAPDH上游引物5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，下游引物5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。

2.9 统计学分析

3 结果

3.1 CMCR 不同提取部位化学成分鉴定结果

对CMCR 不同配伍比例（1∶1、2∶1）的不同提取部位（95%、80%、70%、60%、50%乙醇）化学成分进行解析鉴定，共获得30 个共有成分（表1），包括异喹啉类生物碱、其他类生物碱、有机胺类等。

表1 UPLC-Q-TOF-MS 正离子模式下CMCR 不同配伍比例及提取部位的共有成分Table 1 Common components of CMCR in different compatibility ratio and extraction parts under positive ion mode of UPLC-Q-TOF-MS

3.2 CMCR 对MCF-7/ADR 细胞耐药性的影响

CCK-8 实验结果表明，阿霉素对MCF-7/ADR细胞的IC50为（23.58±1.03）µmol/L。如图1 所示，CMCR 不同配伍比例（1∶1、2∶1）的不同提取部位作用于MCF/ADR 细胞72 h 后，抑制率最大的为CMCR（1∶1）95%乙醇提取部位组，其IC50为（450.57±24.18）μg/mL。如图2 和表2 所示，CMCR不同配伍比例（1∶1、2∶1）的不同提取部位联合阿霉素给药后，阿霉素对MCF-7/ADR 细胞的IC50均有明显下降，其中逆转耐药倍数最大的为阿霉素联合CMCR（1∶1）95%乙醇提取部位组，逆转耐药倍数为11.08。结果表明，CMCR 能有效逆转MCF-7/ADR 细胞对阿霉素的耐药性，且在一定质量浓度范围内，CMCR 的质量浓度与逆转效果呈正相关。

图1 CMCR 对MCF-7/ADR 细胞的增殖抑制作用 (±s, n = 6)Fig.1 Inhibitory effect of CMCR on proliferation of MCF-7/ADR cells (±s, n = 6)

图2 CMCR 联合阿霉素对MCF-7/ADR 细胞的增殖抑制作用 (±s, n = 6)Fig.2 Inhibitory effect of CMCR combined with adriamycin on proliferation of MCF-7/ADR cells (±s, n = 6)

表2 CMCR 逆转MCF-7/ADR 细胞对阿霉素耐药的作用Table 2 Reversing effect of CMCR on MCF-7/ADR cells to adriamycin

3.3 CMCR 化学成分与逆转乳腺癌耐药作用的相关性分析

CMCR 共有峰与逆转耐药倍数的PCC 见图3-A，共有6 种有效成分的|PCC|＞0.80，影响值由大到小排序为G1＞G2＞G3＞G4＞G5＞G6。CMCR共有峰与逆转耐药药效的GRA 结果如图3-B 所示，有12 种有效成分灰色关联度系数＞0.80，影响值由大到小排序为G1＞G2＞G6＞G3＞G12＞G8＞G7＞G10＞G15＞G9＞G16＞G13。对2 种分析方法的结果进行综合分析可知，同时满足|PCC|＞0.80 以及灰色关联度系数＞0.80 的有效成分有5 种，分别为白屈菜碱（G1）、延胡索乙素（G2）、小檗碱（G3）、二氢血根碱（G6）、白屈菜红碱（G10），初步确定该5 种化合物为CMCR 发挥逆转MCF-7/ADR 细胞耐药作用的潜在药效物质。又由于白屈菜碱和延胡索乙素2种成分在GRA中关联度最大，分别为0.900和0.897；同时，二者在Pearson 相关分析中也获得了最大的相关系数，分别为0.910 和0.903，说明白屈菜碱和延胡索乙素与CMCR 逆转耐药的相关性最大。采用PLS 分析方法进行了再次验证，得到了变量投影重要性（variable important projection，VIP）值，见图4。一般认为|VIP|＞1 的X变量对于Y变量有显著的影响，具有统计学意义。结果显示，白屈菜碱和延胡索乙素的VIP 值排在前2 位，它们在逆转耐药药效方面发挥了较大的贡献。这个结论与前2 种相关性分析结果相印证。因此，进一步选择白屈菜碱和延胡索乙素联合配比应用，进行后续验证实验和机制研究。

图3 CMCR 不同提取部位共有成分峰面积与逆转耐药作用相关性分析结果Fig.3 Correlation analysis between common component peak areas and resistance reversal efficacy of different extraction parts of CMCR

图4 CMCR 不同提取部位共有成分峰面积与逆转耐药作用PLS 分析的VIP 图Fig.4 VIP map of PLS analysis between common component peak areas and resistance reversal efficacy of different extraction parts of CMCR

3.4 白屈菜碱和延胡索乙素配伍比例的确定

为了进一步验证潜在药效物质，采用CCK-8 法测定白屈菜碱和延胡索乙素对MCF-7/ADR 细胞的增殖抑制作用，以确定二者最佳配伍比例。如图5所示，白屈菜碱和延胡索乙素对MCF-7/ADR 细胞的IC20分别为（6.10±0.82）、（6.80±0.43）μmol/L，IC50分别为（17.80±0.86）、（38.95±1.38）μmol/L，表明白屈菜碱和延胡索乙素对MCF-7/ADR 细胞具有明显的增殖抑制作用。由图6 可知，白屈菜碱-延胡索乙素的ZIP 评分为5.158，表明2 种药物的反应是加和相互作用。Synergy Finder 分析2 种药物有效浓度范围均在5～10 µmol/L，故延胡索乙素的低、高剂量设定为5、10 µmol/L。考虑到课题组前期的白屈菜碱对MCF-7/ADR 细胞耐药药效学研究结果[10]，选用3、6 µmol/L 作为白屈菜碱的低、高剂量。综上，后续实验选用白屈菜碱和延胡索乙素2 种成分继续探究CMCR 逆转耐药的相关机制。

图5 白屈菜碱和延胡索乙素对MCF-7/ADR 细胞的增殖抑制作用 (±s, n = 6)Fig.5 Inhibitory effects of chelidonine and tetrahydropalmatine on proliferation of MCF-7/ADR cells (±s, n = 6)

图6 Synergy Finder 分析结果Fig.6 Synergy Finder analysis results

3.5 白屈菜碱-延胡索乙素对MCF-7/ADR 细胞内罗丹明123 含量的影响

罗丹明123 作为P-gp 的底物，通过P-gp 转运而被排出细胞，易蓄积在P-gp 低表达的细胞中。荧光显微镜观察白屈菜碱-延胡索乙素对MCF-7/ADR细胞内罗丹明123 含量的影响，可反映白屈菜碱-延胡索乙素对P-gp 表达的影响。如图7 所示，对照组细胞内荧光强度最低；经阿霉素或不同浓度的白屈菜碱-延胡索乙素处理后的耐药细胞，罗丹明123 在细胞质内的蓄积程度不断增强，呈剂量相关性。与阿霉素组比较，白屈菜碱-延胡索乙素组联合ADR组的荧光强度随着药物浓度的增加而显著增强，表明白屈菜碱-延胡索乙素降低了P-gp对底物的外排，促进MCF-7/ADR 细胞内罗丹明123 的蓄积。

图7 白屈菜碱-延胡索乙素联合阿霉素对MCF-7/ADR 细胞内罗丹明123 蓄积的影响 (×400)Fig.7 Effect of chelidonine-tetrahydropalmatine combined with adriamycin on accumulation intensity of rhodamine 123(× 400)

3.6 白屈菜碱和延胡索乙素单体与BCRP、LRP、MDR1 蛋白分子对接结果分析

白屈菜碱与BCRP、LRP、MDR1 耐药相关蛋白的对接得分分别为−35.56、−29.29、−30.96 kJ/mol，延胡索乙素与BCRP、LRP、MDR1 耐药相关蛋白的对接得分分别为−29.71、−24.27、−25.52 kJ/mol，结果均小于−16.74 kJ/mol[29]，说明其具有潜在的结合活性以及低结合能量的稳定性。选取对接结合能量最低的构象用于对接结合模式分析，并使用Discovery Studio 4.5.0 软件绘制3D 和2D 图像（图8）。

图8 耐药相关蛋白与活性化合物分子对接作用方式Fig.8 Docking mode of drug resistance related proteins and active compounds

3.7 白屈菜碱-延胡索乙素对MCF-7/ADR 细胞内耐药相关蛋白和基因表达的影响

如图9 所示，与对照组比较，不同浓度的白屈菜碱-延胡索乙素处理MCF-7/ADR 细胞后，P-gp、LRP、BCRP 蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01），MDR1、LRP和ABCG2mRNA 表达水平均显著下调（P＜0.001），且高剂量组联合阿霉素的作用最佳。表明白屈菜碱-延胡索乙素逆转乳腺癌细胞阿霉素耐药作用与下调P-gp、LRP、BCRP 蛋白及mRNA表达有关。

图9 白屈菜碱-延胡索乙素对MCF-7/ADR 细胞耐药相关蛋白和基因表达的影响 (±s, n = 3)Fig.9 Effect of chelidonine-tetrahydropalmatine on expressions of resistance-related proteins and genes in MCF-7/ADR cells (±s, n = 3)

4 讨论

新辅助化疗是乳腺癌的主要术前治疗方法。在乳腺癌主要分型中，Luminal A 亚型患者占总体乳腺癌患者的70%，该亚型患者具有较低的病理分级和复发风险。然而，对于Luminal A 亚型患者进行新辅助化疗后，观察到病理完全缓解率低至10%，即病理学上完全消除肿瘤的比例较低[30-31]。阿霉素是一种用于新辅助化疗的蒽环类药物，联合曲妥珠单抗、紫杉醇等药物能显著改善病理完全缓解率，但长期使用会使机体产生耐药性和血液毒性[32]。近年来，中药在乳腺癌治疗方面得到广泛应用，其既可以抑制乳腺癌的扩散和转移，还能缓解西医疗法带来的耐药性，是肿瘤化疗辅助治疗的重要手段[33]。白屈菜-元胡药对是中医临床治疗乳腺癌的常用药对之一，白屈菜苦辛、微温，入肝、肺、胃；延胡索辛苦而温，入肝、脾、心，二者联用既能治血瘀疼痛，又能治气滞疼痛，故而中医常将白屈菜和元胡合用于肝郁气滞型乳腺癌的早期治疗[6]。本课题组前期研究以及文献报道表明，白屈菜和元胡中的有效成分可通过下调乳腺癌耐药细胞中P-gp 等耐药相关蛋白的表达逆转MCF-7/ADR 细胞对阿霉素的抗性[5,34-35]，但是CMCR 逆转乳腺癌阿霉素耐药的作用及药效物质尚未得到系统阐明。

为此，本研究在采用UPLC-Q-TOF-MS 阐明CMCR 不同提取部位化学成分全貌及逆转耐药药效的基础上，运用2 种化学计量学方法考察30 个共有峰峰面积与CMCR 不同提取部位逆转耐药药效的相关性，筛选确定白屈菜碱、延胡索乙素、小檗碱、二氢血根碱、白屈菜红碱为CMCR 逆转乳腺癌阿霉素耐药作用的潜在药效物质。近些年文献研究表明，白屈菜碱可逆转非小细胞肺癌吉非替尼耐药，其机制为作用于表皮生长因子受体，激活磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-dependent/activated protein kinase，AMPK）信号通路，进而抑制线粒体的氧化磷酸化，诱导细胞凋亡[36]；延胡索乙素可以通过在ERα 上积累泛素链来促进ERα 降解，增强ERα 乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感性[37]；小檗碱可激活AMPK 并降低其下游蛋白缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的含量，进而抑制P-gp 表达，增强阿霉素对乳腺癌耐药细胞的敏感性[38]；二氢血根碱通过下调mut-p53 蛋白诱导G0/G1期和G2/M 期阻滞，通过丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路诱导细胞凋亡，进而抑制胰腺癌PANC-1 和SW1990细胞增殖作用[39]；白屈菜红碱可有效抑制蛋白激酶Cα（protein kinase Cα，PKCα）的磷酸化，降低MDR1的转录水平，抑制P-gp 对化疗药物的转运功能，进一步发挥逆转耐药作用[40]。以上研究结果提示CMCR 具有潜在逆转乳腺癌阿霉素耐药的作用，进一步采用PLS 分析得出白屈菜碱和延胡索乙素对MCF-7/ADR 细胞的逆转耐药作用的影响值最大，且它们又分别归属于2 种中药的有效成分之一，故而将白屈菜碱联合延胡索乙素作为CMCR 发挥逆转耐药作用的配伍成分进行了实验验证和机制探讨。抑制膜转运体的表达是中药逆转阿霉素耐药的机制之一[41-42]。本研究采用荧光显微镜观察发现，白屈菜碱-延胡索乙素可显著增加MCF-7/ADR 细胞中P-gp 底物罗丹明123 的蓄积量。而Western blotting 和qRT-PCR 结果也表明，白屈菜碱-延胡索乙素可降低P-gp 等耐药蛋白的表达，说明白屈菜碱-延胡索乙素组分可能是通过下调P-gp 的转录和表达进而减少阿霉素的外排，增加细胞内阿霉素浓度，最终发挥逆转耐药作用，但其分子机制尚待进一步深入研究。

本研究基于液质联用技术，采用体外耐药细胞模型阐明了CMCR 逆转耐药作用药效物质，且其药效物质组白屈菜碱-延胡索乙素能够通过下调MCF-7/ADR 细胞P-gp、BCRP 和LRP 蛋白的转录和翻译，抑制外排蛋白活性，增加细胞内阿霉素含量蓄积，进而发挥抗肿瘤作用。本研究为应对乳腺癌患者对阿霉素产生的耐药性问题提供了新的研究思路和方法，并为进一步研究和开发CMCR 奠定了基础。但CMCR 逆转乳腺癌阿霉素耐药性的确切机制还需进一步开展研究加以阐释，是否存在其他通路参与逆转耐药也是下一步实验开展的方向。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突