基于“初生-次生代谢产物”互作途径的大果沙棘和中华沙棘差异性研究

杨兴晶，刘妍如*，唐志书, ，宋忠兴，周 篷，常百金，赵艳婷，刘长乐

1.陕西中医药大学 陕西中药资源产业化省部共建协同创新中心，陕西 咸阳 712083

2.长春中医药大学，吉林 长春 130117

3.中国中医科学院，北京 100700

沙棘HippophaeFructus为胡颓子科植物中华沙棘HippophaerhamnoidesL.的干燥成熟果实，本品系蒙古族、藏族习用药材[1]，也是一种重要的药食同源药材[2]。其具有可健脾消食、止咳祛痰、活血散瘀的功能[3]和调血脂、降血糖、抗癌等功效[4]。沙棘含有黄酮[5]、鞣质、萜类、多糖、维生素等多种活性成分，其中黄酮类成分是沙棘的主要功效物质[3]。

大果沙棘Hippophaerhamnoidesvat.sp L.原产自俄罗斯，是近年来中国从俄罗斯引进的新品种和杂交选育的品种，表现出枝条无刺或少刺、果实大、果柄长、单株产量高等特性。其果实中含有黄酮、氨基酸、维生素等多种生物活性物质[6]，具有广泛的食用、美容和药用开发价值[7]。

沙棘许多药用功效都是通过黄酮类化合物发挥作用才实现的，其含有的黄酮糖苷、苷元等一些生物活性成分比较丰富，在将沙棘果实作为保健和药用方面有着十分广阔的前景[8]。大果沙棘作为俄罗斯引进的选育良种的沙棘，其在国内的研究多以种植、栽培和杂交为主[9-11]，而中华沙棘在药用上使用较多，且已有研究表明引进沙棘（大果沙棘）的黄酮类化合物含量较低[8,12]，安雄韬等[13]、付依依等[14]对不同品种大果沙棘果实与不同品种的沙棘总黄酮含量进行分析，结果表明总黄酮含量最高的均是中华沙棘，所以中华沙棘在药用方面的使用频率要大于大果沙棘。由于品种不同，药用植物中化学成分含量不同，高韵等[15]用红外光谱对不同种属、不同产地的黄精进行鉴别研究，李国卫等[16]利用多元统计分析对不同柯子属药材进行多指标成分含量测定，得到不同种黄精属、柯子属药材间所含化学成分及含量亦存在明显差异，结果都可系统、全面地为药材的质量评价提供科学依据。

植物代谢物组学研究不同物种、不同基因类型或不同生态类型的植物在不同生长时期或受某种刺激干扰前后的所有小分子代谢产物，对其进行定性、定量分析，并找出代谢变化的规律[17]。本研究采收了不同产地中华沙棘和大果沙棘，借鉴植物代谢组学的思路，采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技术对中华沙棘、大果沙棘的差异性成分进行分析，通过多元统计分析与定量分析找出其中差异显著的化学成分及其变化规律，最后通过化学成分的含量差异对生物合成途径的进行分析。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent1290 型高效液相色谱串联AB Sciex 4500 Qtrap 三重四级杆线性离子阱质谱仪（美国Agilent 公司，美国AB Sciex 公司）；Waters Acquity UPLC H-Class 型超高效液相色谱串联 Triple TOFTM5600 三重四级杆飞行时间质谱仪（美国Waters 公司，美国AB Sciex 公司）；KQ-300DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；十万分之一电子天平（Sartorius 科学仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；TQ-200 型高速多功能粉碎机（上海市天祺盛世科技有限公司），Milli-Q 型水纯化系统（美国Millipore 公司）。

1.2 材料

对照品鼠李素（批号wkq21083007，质量分数98%）、二水槲皮素（批号wkq-21080908，质量分数97%）、木犀草苷（批号wkq18032905，质量分数98%）购自四川省维克奇生物科技有限公司；对照品异鼠李素（批号MUST-21082713，质量分数99.27%）、木犀草素（批号MUST-21072311，质量分数98.52%）、水仙苷（批号MUST-20101407，质量分数99.99%）购自成都曼斯特生物科技有限公司；异鼠李素-3-O-葡萄糖苷（批号HR2711W2，质量分数98%）、山柰酚（批号HR1832W2，质量分数98%）购自宝鸡辰光生物科技有限公司；异槲皮苷（批号111809-201403，质量分数92.9%）、金丝桃苷（批号111521-201809，质量分数94.9%）、槲皮苷（批号111538-202007，质量分数93.5%）、槲皮素（批号100081-201610，质量分数99.1%）、芦丁（批号100080-201811，质量分数91.7%）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（批号112007-202103）购自中国食品药品检定研究院；对照品L-酪氨酸（批号0609-0109）、L-苯丙氨酸（批号624-200104）购自中国食品药品检定研究院；柚皮素（批号200824，质量分数98%）购自成都植标化纯生物技术有限公司。甲醇（分析级，成都市科隆化学品有限公司），乙腈（质谱级，批号205179，赛默飞世尔科技有限公司公司），甲醇（色谱级，德国默克公司），甲酸（批号205775，赛默飞世尔科技有限公司公司），水为超纯水（密理博Milli-Q Integral 5 超纯水机制备）。

样品为不同产地沙棘（表1），经陕西中医药大学药学院白吉庆副教授鉴定为胡颓子科植物中华沙棘H.rhamnoidesL.和大果沙棘H.rhamnoidesvat.sp L.的干燥成熟果实。

表1 各批次沙棘信息Table 1 Hippophae Fructus information for each batch

2 方法

2.1 样品的干燥

取各批次中华沙棘和大果沙棘果实进行清洗，分别取各批次2 种果实适量，进行标记，装入不锈钢托盘中均匀摊开，所有样品在60 ℃烘箱中干燥12 h，干燥后粉碎，过三号筛，装袋保存。

2.2 总黄酮含量测定[1]

2.2.1 对照品溶液的制备 取芦丁对照品20 mg，精密称定，置50 mL 量瓶中，加60%乙醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷，加60%乙醇至刻度，摇匀。精密量取25 mL，置50 mL 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得0.2 mg/mL 芦丁对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品粗粉约2 g，精密称定，加60%乙醇30 mL，加热回流2 h，放冷，滤过，残渣再分别加60%乙醇25 mL，加热回流2 次，每次1 h，滤过，合并滤液，置100 mL 量瓶中，残渣用60%乙醇洗涤，洗液并入同一量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀。精密量取25 mL，置50 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.2.3 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液l、2、3、4、5、6 mL，分别置25 mL 量瓶中，各加30%乙醇至6.0 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀，放置6 min，再加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min。加氢氧化钠试液10 mL，再加30%乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法（通则0401），在500 nm 的波长处测定吸光度（A）值，以A值为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线。

2.2.4 总黄酮的测定 按“2.3.2”项下方法测定A值。根据标准曲线计算沙棘中总黄酮的含量。

2.4 成分表征测定

2.3.1 对照品溶液的制备 分别精密称取芦丁、槲皮苷、异鼠李素、鼠李素、水仙苷、槲皮素、木犀草素、金丝桃苷、柚皮素、木犀草苷、山柰酚、山柰酚-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、二水槲皮素、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸对照品适量，制成质量浓度分别为0.15、0.21、0.21、0.16、0.11、0.13、0.12、0.20、0.17、0.10、0.10、0.11、0.14、0.13、0.16、0.14 mg/mL 的对照品储备液。储备液于4 ℃条件下保存备用。

2.3.2 供试品溶液的制备 精密称取“2.1”项下14批产地的沙棘药材粉末各1.5 g 于锥形瓶中，分别加入60%甲醇30 mL，85 ℃水浴回流1 h，放冷，滤过，取续滤液，过膜，备用。

2.3.3 UPLC 色谱条件 采用5600 型质谱仪进行成分表征，色谱柱为Acquity UPLC®BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为0.1%甲酸-水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～1 min，6% B；1～8 min，6%～20% B；8～30 min，20%～95% B；30～32 min，95% B；32～33 min，95%～5% B；33～35 min，5% B；柱温35 ℃，体积流量0.3 mL/min，进样量为5 μL。

2.3.4 质谱条件 离子源为电喷雾离子源（ESI），负离子模式下，采用信息依赖采集（IDA）、动态背景扣除（DBS）和高灵敏度模式采集数据。离子扫描范围m/z100～2 000，负离子模式下源喷射电压为−4 500 V，裂解电压（declustering potential，DP）为80 V，碰撞能量（collision energy，CE）为35 eV，负离子模式下，雾化气（ion source gas 1，GS1）和辅助气（ion source gas 2，GS2）为氮气，均为344.7 kPa，气帘气（curtain gas，CUR）为241.3 kPa，雾化温度（temperature，TEM）550 ℃。

2.4 二水平析因（plackett burman，PB）-星点设计（central composite design，CCD）法（PB-CCD）实验设计

2.4.1 影响因子设计 采用比例特定的乙腈-水混合洗脱系统，以不同比例甲酸调节流动相系统pH 值。选用不同色谱柱类型、检测波长、柱温、线性梯度时间、体积流量、乙腈初始比例和进样体积作为考察变量，以2 峰分离度之和（∑Rs）、归一化分离因子（r*）、色谱信息量（Ф）和色谱分层响应效能（HCRF）作为响应因子[18]，因素水平见表2。

表2 影响因子及响应因子设计Table 2 Impact factor and response factor design

2.4.2 数据分析 以各因素无相互作用且对设计结果干扰少作为设计前提，采用Design-Expert Version 8.0.7 统计软件，首先对检测波长、柱温、梯度时间、进样体积、体积流量、酸浓度、乙腈初始比例和色谱柱类型进行PB 因子筛选；然后以CCD 响应曲面法对重要因素进行寻优，以确定最优的参数设置，见表3。

表3 Plackett-Burman 设计实验方案 (n = 3)Table 3 Placket-Burman design experimental scheme (n = 3)

2.5 指纹图谱的建立

2.5.1 UPLC 色谱条件 色谱柱为Zorbax SB-C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流动相为0.1%甲酸-水溶液（A）-乙腈溶液（B），梯度洗脱程序：0～3 min，2%～9% B；3～20 min，9%～15% B；20～26 min，15%～16.5% B；26～30 min，16.5%～23% B；30～33 min，23%～24% B；33～42 min，24%～38% B；42～43 min，38%～95% B；43～45 min，95%～5% B。检测波长370 nm，柱温35 ℃，体积流量0.3 mL/min，进样量5 μL。

2.5.2 指纹图谱方法学验证 按照《中国药典》2020年版一部对中药质量控制方法的规定，对优化结果进行精密度、重复性、稳定性等方法学验证。以金丝桃苷、芦丁、异槲皮苷、木犀草苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素为对照，鉴定指纹图谱中共有成分。

2.6 沙棘差异性成分聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）及偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）

2.6.1 HCA 为了初步说明样品与样品间是否存在一定关系，本研究选用HCA 进行建模分析。首先对中华、大果沙棘样品进行色谱分析，再将处理后的峰面积导入simca-p 14.1 版软件，最后采用HCA方法对各批数据进行分析。

2.6.2 PLS-DA 为了更直观地评价模型对样品的分类能力，对各样品数据进行降维处理，将数据导入simca-p 14.1 版软件，采用PLS-DA 方法观察样品差异情况。本研究对中华、大果沙棘样品进行成分鉴定与色谱分析，将测定后的中华沙棘、大果沙棘相同的成分的峰面积进行处理，将处理并分组后的数据采用PLS-DA 进行分析。

2.7 差异代谢物定量分析

2.7.1 定量UPLC 色谱条件 采用4500 型质谱仪进行成分定量，色谱条件同“2.6.1”项指纹图谱色谱条件。

2.7.2 质谱条件 定量质谱分析采用ESI 负离子模式进行扫描，检测模式为多反应检测（MRM）。离子化参数为离子喷雾电压，负离子模式−4 500 V；雾化气和辅助气为氮气；离子源温度550 ℃，雾化气和辅助为413.7 kPa，气帘气压力为241.3 kPa，离子扫描范围m/z100～1 000，扫描速率：200 Da/s，化合物离子对，优化后的采集参数：去簇电压（declustering potential，DP）、碎裂能量（collision energy，CE）和碰撞池出口电压（cell exit potential，CXP）等信息见表4。

表4 沙棘中11 种黄酮类、氨基酸化合物多反应检测参数Table 4 Multiple reaction parameters of 11 kinds of flavonoids and amino acids in Hippophae Fructu

2.8 统计分析

3 结果与分析

3.1 总黄酮含量测定结果

按“2.3.3”项下方法绘制标准曲线，得到线性回归方程为Y＝12.491X＋0.003 8（r2＝0.999 3），线性范围为0.008 0～0.048 0 mg/mL。按“2.3.3”项下方法对14 批沙棘样品进行总黄酮含量的测定，结果见表5。

表5 不同产地中华沙棘、大果沙棘总黄酮含量测定结果 (n = 6)Table 5 Determination results of total flavonoids of H.rhamnoides and H.rhamnoides vat.sp from different producing areas (n = 6)

3.2 成分表征测定结果

通过Peakview 2.2 查看采集数据，以AB Sciexmaster view 1.1.0.0 中药成分数据库（TCM library 1.0）作为中华沙棘和大果沙棘的成分匹配库。通过比对精确质量数、同位素峰度比以及碎片离子裂解规律等信息，初步鉴定出中华沙棘和大果沙棘中含量差异较大的有9 个黄酮类成分和2 个氨基酸成分并对其进行分析，见表6，总离子流图见图1。

图1 中华沙棘 (A) 和大果沙棘 (B) 化学成分表征的UPLC-MS/MS 总离子流图Fig.1 UPLC-MS/MS total ion flow maps of characterization of chemical constituents of H.rhamnoides (A) and H.rhamnoides vat.sp (B)

表6 中华沙棘、大果沙棘中11 个重要共有成分Table 6 A total of 11 important common components in H.rhamnoides and H.rhamnoides vat.sp

3.3 PB-CCD 实验设计结果

3.3.1 液相色谱优化因子选择 由于甲醇和分析物间氢键的相互作用，可能引入额外的共振结构并可能引起拖尾峰，因此，选择乙腈作为有机相。另外，色谱柱温度也是影响极性化合物保留时间的重要参数，一般温度升高，扩散系数也升高，这样会导致更窄的峰和更高的分离效率。为了增加色谱柱使用寿命，将柱温优化范围设置为25～35 ℃。

3.3.2 PB 试验设计 为了在最少的试验次数下获得最佳的参数设置，选择因子设计中的PB 法作为筛选设计方法，以CCD 响应曲面法对优化后的因素进行进一步优化，以∑Rs、r*、Ф、HCRF评价样品的分离效能，见公式（1）～（3）。结果见表7。

表7 PB 响应因子结果Table 7 PB response factor results

R表示2 峰间分离度；n为理论塔板数；Rmin为最小分离度；tm−t1为最大与最小保留时间差；A为色谱峰面积。∑Rs、r*是用于评价色谱分离质量的参数；Ф值指色谱信息量值，是用于评价色谱交互信息的参数；HCRF为分层色谱响应值，用于评价方法中分离峰个数、分离度和分析时间性能

PB 试验的ANOVA 结果显示，Ф和HCRF项的P值分别为0.030 9 和0.039 2，均小于0.05，说明各变量与HCRF回归方程的关系显著。拟合系数（R-Squared）分别为0.970 9 和0.965 7，说明模型拟合度好。

根据各影响因子对各响应因子的最大值运算结果，将影响不显著的影响因子进行最大值预测并作为固定条件：检测波长为370 nm，柱温为35 ℃，体积流量为0.3 mL/min；甲酸浓度为0.1%进样量为5 μL，色谱柱类型为Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。

3.3.3 CCD 试验设计 在PB 设计结果的基础上，通过对Ф和HCRF影响显著的因子检测波长、进样体积和流速进行寻优。试验采用通用旋转组合设计（Rotatable＝6），以Ф和HCRF作为响应因子进行3 水平CCD 试验（表8）。根据试验结果，找到Ф和HCRF最大值。

表8 CCD 响应因子结果Table 8 CCD response factor results

从Ф和HCRF项的ANOVA 表中变量显著性P值的大小可以确定对Ф和HCRF的影响大小，对Ф影响显著的因素为进样体积（P＝0.004 8）、体积流量（P＝0.042 3）和色谱柱类型（P＝0.030 5）；对HCRF影响显著的因素为进样体积（P＝0.007 6）、乙腈初始比例（P＝0.048 3）和色谱柱类型（P＝0.037 6）。从Ф和HCRF主效应图（图2-a、c）可以看出，3 因素交互作用显著，进样体积（因素A）越大，图谱Ф和HCRF越高；体积流量（因素B）越大，图谱Ф和HCRF越低。

图2 分离效果影响因素主效应及响应曲面分析图Fig.2 Main effect diagrams of influencing factors of separation effect and response surface analysis diagrams

根据该筛选的结果，在设计水平范围内对响应因子做最大值计算。因此，根据评价结果，得到最后的优化参数，用3 次重复试验来验证因子分析结果，得到初步的色谱分析条件为：色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），检测波长370 nm，柱温35 ℃，梯度时间45 min，进样体积5 μL，体积流量0.3 mL/min，乙腈初始比例2%，甲酸浓度0.1%。

3.4 指纹图谱结果

3.4.1 精密度试验 取同一产地沙棘供试品溶液，按“2.6.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录370 nm 波长下色谱图。对10 个共有峰以均值法进行差异性评价，结果表明10 个共有峰相对保留时间RSD为0.006%～0.061%，皆小于1.5%。共有峰相对峰面积RSD 为0.232%～2.701%，皆小于3%。精密度考察结果符合指纹图谱的要求。

3.4.2 稳定性试验 取同一产地沙棘供试品溶液，分别于制备后0、3、6、9、12、15、18、24 h 按“2.6.1”项下色谱条件进样，记录370 nm 色谱图。共有峰以均值法进行评价，结果表明各共有峰相对保留时间RSD 为0.015%～0.134%，皆小于1.5%。各共有峰相对峰面积RSD 为0.325%～2.789%，皆小于3%，证明供试品溶液在24 h 内稳定。

3.4.3 重复性试验 取同一产地沙棘供试品6 份，分别制备供试品溶液，按“2.6.1”项下色谱条件进样，记录370 nm 下色谱图。对其共有峰分别进行差异性评价，结果表明，各主要成分共有峰相对保留时间RSD 为0.007%～0.103%，皆小于1.5%。共有峰相对峰面积RSD为0.104%～2.877%，皆小于3%，重复性考察结果符合指纹图谱的要求。

3.4.4 沙棘共有峰鉴定 取14 批沙棘及对照混标，按“2.1”项下方法分别制备供试品溶液，进样，记录色谱图。通过与混合对照品图谱比较，确定10 个共有峰，分别为金丝桃苷、芦丁、异槲皮苷、木犀草苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素，各批次样品叠加图与对照图谱见图3。

图3 各批次沙棘和混合对照品溶液指纹图谱Fig.3 Fingerprints of each batch of Hippophae Fructus and mixed control solution

3.5 沙棘差异性成分HCA 及PLS-DA 结果

3.5.1 聚类分析 得到树状图结果见图4-A。结果表明，沙棘样品主要分为2 类，中华沙棘样品归为一类，大果沙棘样品聚为一类。说明中华沙棘和大果沙棘的样品在成分上存在一定的差异。

图4 中华沙棘、大果沙棘PLS-DA、聚类与KEGG 结果Fig.4 PLS-DA, cluster analysis and KEGG results of H.rhamnoides and H.rhamnoides vat.sp

3.5.2 PLS-DA 结果得到前2 个主成分的贡献度为93.1%，包含差异信息最多，模型拟合度为90.0%，模型拟合度良好，故选取前2 个主成分进行模型预测，反映出不同种属间样品的基本特征。以2 个主成分建立投影，得到散点图（图4-B）。由图可以看出所有中华沙棘样品分为一类，所有大果沙棘样品分为另一类，这一结果与聚类分析（图4-A）结果一致。说明中华沙棘、大果沙棘在成分上有明显的差异。利用VIP（variable importance in projection）值（VIP＞1）与MetaboAnalyst 分析平台（https://www.metaboanalyst.ca/）将处理后的数据进行差异初生代谢物的筛选与KEGG 通路富集分析，通过VIP 值筛选到19 个差异代谢物，KEGG 通路富集分析得到14 条代谢途径（图4-D）。结果得到2 个重要的差异代谢物L-苯丙氨酸与L-酪氨酸与3 个重要代谢途径：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成代谢、苯丙氨酸代谢与酪氨酸代谢。

3.6 差异代谢物定量分析结果

根据PLS-DA 分析中得到的差异代谢物信息，对已鉴定得到的重要差异初生代谢物及其次生代谢物进行定量方法学考察。

3.6.1 标准曲线、定量限和检测限试验 精密吸取“2.2.1”项下对照品储备液，配制为不同体积的对照品储备液，按照优化的液质条件进行测定。将对照品储备液按梯度体积稀释，精密吸取11 个稀释成不同质量浓度梯度的混合对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以标准溶液中化合物质量浓度横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算各成分的回归方程和线性范围。中华沙棘、大果沙棘中11 个不同化合物的线性范围为0.003 6～30.00 μg/mL，且相关系数均大于0.999，表明各对照品线性关系良好。各种化合物的线性方程、相关系数、线性范围及方法定量限、检测限见表9。

3.6.2 精密度试验 取同一产地中华沙棘的供试品溶液，按“2.8.1”项下色谱条件连续进样6 次，测得异鼠李素、山柰酚、槲皮素、金丝桃苷、芦丁、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸等11 个成分各色谱峰的峰面积，计算中华沙棘中11 种化合物峰面积的RSD 在1.12%～3.99%，表明仪器精密度良好。

3.6.3 稳定性试验 取同一产地中华沙棘的供试品溶液，按“2.8.1”项下色谱条件分别于制备后0、2、4、6、10、14、20、24 h 进样，测得异鼠李素、山柰酚、槲皮素、金丝桃苷、芦丁、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸等11 个成分各色谱峰面积，计算中华沙棘中11 种化合物峰面积的RSD 在1.42%～4.87%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

3.6.4 重复性试验 取同一产地中华沙棘药材粉末6 份，按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，按“2.8.1”项下色谱条件，进样，测得异鼠李素、山柰酚、槲皮素、金丝桃苷、芦丁、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸等11 个成分各色谱峰面积，计算中华沙棘中11 种化合物质量分数的RSD 在2.27%～4.82%，表明此方法重复性良好。

3.6.5 加样回收率试验 精密称取同一产地中华沙棘的供试品各约1.5 g，共6 份，置于150 mL锥形瓶中，分别精密加入与中华沙棘样品含量等同量的混合对照品溶液（异鼠李素、山柰酚、槲皮素、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸等11 个成分），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.8.1”项色谱条件下进样，计算加样回收率。各成分含量、加入量以及最后得到的平均加样回收率和RSD 的结果，异鼠李素、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、山柰酚、槲皮素、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、柚皮素、水仙苷、鼠李素、二水槲皮素、木犀草素平均加样回收率分别为95.32%、103.30%、95.46%、99.28%、95.26%、101.22%、104.61%、101.41%、98.86%、102.62%、96.48%；RSD 分别为3.42%、3.67%、1.37%、2.07%、0.87%、2.10%、0.72%、2.75%、1.31%、2.84%、3.12%。3.6.6 差异成分含量测定 为了更准确地应用定性数据，针对PLS-DA 中得到的差异代谢物信息，将已鉴定得到的差异初生代谢物及其次生代谢物进行定量分析，以精确研究中华沙棘与大果沙棘成分的差异性，按“2.8.1”项下的色谱条件和“2.8.2”项下的质谱条件，采用MRM 模式进行定量分析（表4），标准化合物、样品、空白溶液MRM 提取离子流图见图5，结果见图6。

图5 空白 (A)、中华沙棘样品 (B)、大果沙棘样品 (C) 和11 种对照品 (D) 负离子模式MRM 提取离子图Fig.5 Blank (A), H.rhamnoides (B), H.rhamnoides vat.sp (C), and 11 standards (D) MRM extracted ion chromatograms under negative ion mode

图6 中华沙棘、大果沙棘中11 种黄酮类、氨基酸化合物含量测定结果Fig.6 Determination results of 11 flavonoids and amino acids in the H.rhamnoides and H.rhamnoides vat.sp

4 讨论

4.1 沙棘中黄酮类成分的生物合成途径分析及验证

根据“3.2”项成分表征得到含量差异较大的9 个黄酮类成分和2 个氨基酸成分，分别为异鼠李素、山柰酚、槲皮素、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸等。黄酮类成分的合成主要以L-苯丙氨酸和L-酪氨酸为前体物质，通过不同的分支合成途径合成黄酮类成分[25]，见图7，通过对中华沙棘和大果沙棘的代谢产物分析，发现2 个沙棘中的L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的含量有区别，大果沙棘中的2 种代谢物的含量大于中华沙棘，通过含量测定得到了大果沙棘中9 种黄酮类成分和2 种氨基酸的含量要大于中华沙棘，也进一步验证了不同种属的沙棘，其黄酮类成分的含量有明显的不同。

图7 黄酮类化合物合成途径Fig.7 Synthetic pathway of flavonoids

4.2 中华沙棘、大果沙棘中总黄酮含量分析

总黄酮含量显示，中华沙棘中总黄酮含量要大于大果沙棘中总黄酮含量。成分表征结果初步得到沙棘中26 个黄酮类成分，其中含量差异较大的黄酮类成分有9 个，其在大果沙棘中含量较高，其余已确定的黄酮类化合物含量均是中华沙棘大于大果沙棘。

分析原因一可能是总黄酮含量显示在中华沙棘中较高，而实验中所测得在大果沙棘中含量较高、差异较大的9 个黄酮类成分，是为研究不同种类沙棘差异显著的化学成分及其变化规律，其并不能代表大果沙棘中总黄酮含量，由于表征出的黄酮类成分较少，所以2 个种类之间更多的差异成分还有待深究；原因二可能与黄酮类成分的生物合成途径有关，大量实验证实，植物黄酮类生物合成的前期途径是相同的，都是以丙二酸单酰CoA 与香豆酰CoA（coumaroyl-CoA）为直接前体[26]，其分别与糖代谢、脂质代谢以及氨基酸代谢有关。本研究实验以氨基酸代谢为主要代谢途径，由于KEGG 结果表明苯丙氨酸代谢途径较为显著，所以实验中所测得在大果沙棘中含量较高、差异较大的9 个黄酮类成分可能通过苯丙氨酸代谢途径进行合成。有研究表明，苯丙氨酸代谢途径还涉及常被认为是黄酮类化合物生物合成途径限速酶之一的C4H[27]，所以可能导致大果沙棘中总黄酮含量较中华沙棘低，而实验中所测得的9 个黄酮类成分含量较高。

4.3 中华沙棘、大果沙棘在功效上的评价

由于沙棘许多药用功效都是通过黄酮类化合物发挥作用来实现的，其含有的黄酮糖苷、苷元等一些生物活性成分比较丰富，国内大果沙棘的研究多以种植和杂交为主，其常用于食品、化妆品和医疗保健品方面[7]；而中华沙棘多作为药用，以两者中总黄酮含量结果来看，中华沙棘在功效上可能强于大果沙棘。

综上所述，不同品种沙棘的黄酮类成分在含量上是有差异的，首先其总黄酮含量在中华沙棘中含量较高，说明中华沙棘在药用功效上可能强于大果沙棘；其次异鼠李素测定结果在大果沙棘中含量较高，说明其对临床的质控和应用可能不太适用。实验结果表明可以通过植物代谢组学研究不同品种植物的小分子代谢产物，对其生物合成途径进行分析，并通过定性、定量分析找其初生及次生代谢产物的代谢变化的规律，从而对植物进行更加合理的分类，以上研究方法和结果可以为不同品种沙棘药性、药效差异的物质基础提供依据，并对其成分分析、质量评价的研究提供技术支持和科学依据。

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