p62基因过表达慢病毒载体的构建及表达

张 春,苏 丛,伍 婷,朱立雨

P62/SQSTM1(sequestosome-1,SQSTM1)蛋白是一种重要的自噬衔接蛋白,是最早发现的哺乳动物泛素化底物的自噬受体之一。P62蛋白含有多个功能性结构域,包括泛素相关结构域(ubiquitin-associated domain,UBA)、微管相关蛋白1轻链3作用域(LC3 interacting region,LIR)、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白受体(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein receptor,KIR)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)结合结构域、ZZ型锌指区和Phox-Bem1p(PB1)结构域等6个功能区域[1-3]。其中PB1、LIR和UBA结构域在选择性自噬降解过程中发挥重要作用。P62蛋白异常表达与多种疾病如神经退行性病变、肿瘤、遗传性疾病及感染性疾病的发生发展密切相关[4-7]。因此,该研究旨在通过构建p62基因过表达慢病毒,筛选出P62高表达的人单核细胞白血病细胞(human myeloid leukemia mononuclear cells,THP-1)细胞株,为进一步在体外深入探索p62基因的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1主要材料 人胚肾细胞 293T (human embryonic kidney 293T,HEK 293T)(目录编号:GNHu44)及人单核细胞白血病细胞(THP-1)(目录编号:SCSP-567)均购自中科院上海细胞所。包装质粒pcDNA3.1-Flag-PCDH10(货号:VT8014)及辅助包装质粒pSPAX2(货号:VT1444)和pMD2G(货号:VT1443)购自湖南优宝生物;EcoR Ⅰ(货号:ER0271)和BamH Ⅰ(货号:ER0051)、限制性内切酶、转染试剂Lipofectamine 2000(货号:11668500)、T4连接酶(货号:15224041)、DMSO(货号:D12345)、质粒提取与纯化试剂盒(货号:K0502)、DNA Polymerease(货号:EP0702)、DNA ladder(货号:SM1553)、TRIzol RNA提取试剂(货号:15596026)等均购自美国赛默飞世尔科技公司;Taq酶(货号:R300S)、PrimeScriptTMRT Master Mix(货号:RR036A)和TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ (货号:RR420A)购自日本Takara公司;蛋白Marker(货号:MBP0277-25 μl)、ECL发光液(货号:MBP0297)购自上海毕合生物化学技术有限公司;抗GAPDH抗体(货号:2118L)及抗P62多克隆抗体(货号:5114S)均购自美国Cell Signaling Technology公司,山羊抗兔二抗(货号:ab6721)购自美国Abcam公司;BCA蛋白定量试剂盒(货号:C503021-0500)、大肠埃希菌感受态细胞(DH5α)、PCR引物、琼脂粉(货号:A505255-0250)购于上海生工生物工程股份有限公司。氨苄霉素(货号:A8180)购自北京索莱宝科技有限公司。高糖培养基(Dulbecco's modified eagle medium,DMEM)(货号:C11995500BT)、胎牛血清(fatal bovine serun,FBS)(货号:10270-106)购自美国Invitrogen公司。

1.1.2主要仪器 冷冻超速离心机(型号:Beckman Coulter OPTIMA I-100XP,美国贝克曼库尔特有限公司)、荧光定量PCR仪、超微量核酸蛋白测定仪(型号:ABI 7500、Thermo Nanodrop 2000,美国赛默飞世尔科技公司)、电泳槽和转印芯及核酸蛋白电泳系统(型号:Bio-Rad,美国Bio-Rad公司)、凝胶成像分析系统(型号:Tanon 5200,上海天能生命科学有限公司)、电热恒温培养箱(型号:DNP-9162,常州恒隆仪器有限公司)、生物安全柜(型号:AB2-4A1,新加坡ESCO公司)、细胞培养箱(型号:HERACELL 150L,美国赛默飞世尔科技公司)。

1.2 方法

1.2.1p62基因合成及其慢病毒表达载体的构建 通过GenBank 网站查询小鼠p62基因序列,设计基因引物:P1(5′-CGGAATTCATGGCGTCGTTCACGGTGAAGGCC-3′);P2(5′-AAGGATCCCAATGGTGGAGGGTGCTTCGAATACTGGA-3′);扩增长度:1 342 bp,引物由上海生工生物科技有限公司合成。扩增反应体系:P1和P2引物各1 μl 5×Buffer 10 μl,dNTP Mix 4 μl,模板1 μl,Prime STAR HS DNA polymerase 0.5 μl,双蒸水 32.5 μl,充分混匀,条件如下:98 ℃、5 min,98 ℃、10 s,55 ℃、10 s,72 ℃、90 s,共循环30次,72 ℃、8 min。退火处理后得到带黏性末端的双链片段4 ℃冰箱保存,用于后续连接反应。限制性内切酶在EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ位点对载体进行双酶切,反应体系及条件如下:10×Cut Smart Buffer 5 μl,pcDNA3.1-Flag-PCDH10质粒(1 μg/μl) 2 μl,EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ (10 U/μl)各1 μl,ddH2O 补足至50 μl,充分混匀,37 ℃水浴反应3 h,得到线性化的载体。凝胶电泳后切胶,用DNA凝胶回收试剂盒回收载体pcDNA3.1-Flag-PCDH10。将目的片段与线性载体连接,于冰水浴中配制如下反应体系:线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10载体DNA 4 μl,p62DNA 4 μl,T4连接酶1 μl,T4 Buffer 1 μl,共10 μl。混匀后离心,室温过夜连接。将上述产物转化大肠埃希菌DH5α,经含有氨苄霉素抗性的LB琼脂培养基过夜筛选后,挑取单克隆细胞株送DNA测序鉴定,获取重组p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10质粒,PCR扩增后双酶切凝胶电泳验证。扩大培养阳性DH5α,质粒提取试剂盒提取重组质粒,-20 ℃保存。

1.2.2重组表达p62慢病毒在HEK 293T细胞的包装和转染 转染前1 d,将生长状态良好的HEK 293T细胞接种于6孔板中,待细胞汇合度达70%左右时,将p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10 5 μg、包装质粒pSPAX2 3.75 μg和 pMD2G 1.5 μg加入500 μl Optimum,混匀配制成DNA mixture,室温静置5 min,同时将500 μl Optimum和20 μl Lipofactamine2000混匀,于室温静置20 min,再将DNA mixture与之混匀,均匀滴至HEK 293T细胞中;将细胞置于37 ℃、5% CO2环境中转染 6 h 后 更换为含 10% FBS的新鲜完全培养基,继续培养48 h后收集细胞上清液,使用0.45 μm滤器过滤,4 ℃ 12 000 r/min 离心5 min,继而获得P62过表达慢病毒,-80 ℃冰箱冷冻保存,以备后续实验使用。

1.2.3慢病毒感染THP-1及筛选P62稳定表达株 将2×106个THP-1细胞接种至6孔板,待细胞长至汇合度达50%～60%时,根据病毒感染复数及细胞数量加入相应体积的病毒原液;感染24 h后,更换无病毒的适应性培养基,细胞培养箱中继续培养24 h,利用含氨苄霉素(2 μg/ml)的适应性培养基继续筛选感染病毒的细胞,继续培养3～4 d,直至剩余极少部分THP-1细胞存活,使含p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10慢病毒的THP-1稳定传代,从而得到p62基因高表达THP-1细胞株,即过表达组(over expression,OE),转染不含p62基因空质粒的THP-1细胞株为对照(control,Con)组。

1.2.4RT-qPCR检测p62mRNA 相对表达量 提取氨苄霉素筛选阳性细胞总RNA,根据说明书对PrimeScriptTMRT Master Mix 进行逆转录,逆转录体系及条件为:Dntp Mixture(10 mmol/L) 1 μl、Oligo Dt Primer (2.5 μmol/L) 1 μl、Total RNA 5 μl、无酶去离子水补足至10 μl;37 ℃预反应15 min ;85 ℃扩增5 s。p62mRNA引物序列如下:Forward primer:5′-TTCAGCTTCTGCTTCAGCCC-3′;Reverse primer:5′-CTCCTGAGCACATGGTGGG-3′;GAPDH mRNA引物序列如下:Forward primer:5′-GTCAAGGCCGAGAATGGGAA-3′;Reverse primer:5′-CTCGTGGTTCACACCCATCA-3′;进行 RT-qPCR反应,反应体系及条件为:上述变性、退火后的反应液 10 μl、5×PrimeScriptTMBuffer 4 μl、Rnase Inhibitor (40 U/μl) 0.5 μl、PrimeScriptTMRtase (for 2 Step) 0.5 μl、Rnase Free H2O 5 μl,总体系20 μl;95 ℃预变性 30 s;95 ℃变性5 s,60 ℃退火30 s,共40个循环。采用2-ΔΔCT法计算相对表达量。

1.2.5Western blot 检测THP-1细胞中P62蛋白的相对表达量 经氨苄青霉素筛选阳性THP-1克隆株,培养细胞至对数生长期,加入适量的细胞裂解液RAPI,冰上裂解30 min,12 000 r/min 离心10 min,蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。20 μg样品中加入4×蛋白 Loading buffe,煮沸,冰上冷却,蛋白上样、80 V恒压电泳、转PVDF膜、5%脱脂奶粉室温封闭1 h、分别以抗p62(1∶1 000)和抗GAPDH(1∶5 000) 抗体4 ℃孵育过夜,1×TBST清洗3次,每次8 min,再分别以山羊抗兔二抗 (1∶5 000)室温孵育1 h,1×TBST清洗3次,每次8 min,ECL化学发光法显示蛋白条带。

1.2.6RT-qPCR检测炎症因子mRNA的表达量 肺炎克雷伯(KlebsiellaPneumoniae,K.p.)标椎菌株(ATCC 43816) 感染两组THP-1细胞(细菌∶细胞=10∶1),刺激 6 h 后收集细胞,采用RT-qPCR方法检测两组细胞分泌的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白细胞介素(interleu kin,IL)-1β 和 Cxcl1 的 mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 PCR扩增p62基因片段及含目的基因重组质粒p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10的鉴定目的基因p62PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后显示,在1 342 bp处显示有一明亮特异性扩增条带,片段大小与目的条带一致,表明目的基因扩增成功。将扩增成功的p62目的基因与线性化载体连接,重组质粒图谱如图1所示,后转染DH5α,筛选阳性克隆株,提取质粒,将重组质粒p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10进行扩增后再双酶切进行PCR鉴定,可见被切开如图2所示两条条带,同时经基因测序验证,表明p62目的基因成功插入慢病毒质粒中。

图1 重组质粒图谱

图2 EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ 双酶切重组质粒琼脂糖凝胶电泳鉴定图

2.2 稳转THP-1细胞株p62mRNA的相对表达量RT-qPCR检测结果显示,与Con组相比,OE组p62相对表达量升高(t=8.639,P<0.001)。见图3。

图3 两组细胞p62 mRNA相对表达量的比较

2.3 稳转THP-1细胞株P62蛋白的相对表达量Western blot检测结果如图4所示,OE组P62蛋白表达高于Con组,表明P62稳转THP-1细胞株构建成功。

图4 THP-1细胞株P62蛋白表达图

2.4K.p.感染THP-1细胞炎症因子的mRNA表达量实验组细胞内的炎性因子TNF-α、IL-1β和Cxcl1的相对表达量均高于对照组(t=8.620、4.278、7.551,均P<0.01)。见图5。

图5 两组炎症因子mRNA表达水平的比较

3 讨论

随着分子生物学技术的快速发展,慢病毒载体作为工具广泛运用于基因编辑,人为将目的基因插入慢病毒载体,能高效地将目的基因导入真核生物细胞中,并随着细胞的不断分裂,可稳定并持久地表达目的基因[8-9]。

P62是最早发现的哺乳动物自噬相关受体之一。P62的Phox、PB1、LIR和UBA结构域在自噬降解病原微生物中发挥重要作用。当细菌入侵细胞时,P62在细菌感染细胞早期发挥重要作用。E3连接酶TRIM50、TRAF6、MURF2泛素化胞内细菌,然后被自噬适配器P62和NBR1识别,适配器将细菌定位到自噬小体上,并靶向胞内细菌进行自噬降解[10]。研究[10-11]显示福氏链球菌和结核分枝杆菌以P62依赖的方式被选择性靶向招募并传递到新生的LC3阳性自噬小体中进行降解。在巨噬细胞体外感染实验中,P62与结核分枝杆菌共同定位并控制其生存和复制,而抑制巨噬细胞中的P62可以增加结核分枝杆菌的存活率[12]。本研究构建P62高表达THP-1细胞株,旨在为进一步探究P62在感染性疾病中的作用提供方法。

P62介导的异种吞噬的其他机制也被报道[13],在斑马鱼感染模型中,溶酶体蛋白DRAM-1通过招募P62限制海洋分枝杆菌感染。同时,P62可直接参与炎症的调节[14]。如P62同源和异源性的PB1结构域与丝裂原激活蛋白激酶激活蛋白激酶3相互作用时发生二聚化,进一步共同作用于肿瘤坏死因子受体相关蛋白6,形成P62复合物,该复合物磷酸化和泛素化kappa B 抑制因子激酶复合物,进一步抑制NF-κB信号转导。本研究成功构建高表达P62的THP-1细胞系后,进一步探究在感染模型中P62对炎症因子的影响,发现高表达P62蛋白后促炎因子TNF-α、IL-1β 和Cxcl1的相对表达量均明显增高,这可能与K.p.菌株感染剂量和时间有关。此外,P62在氧化应激调节方面也发挥重要作用,研究[15]显示P62磷酸化后与keap-1相互作用,导致抗氧化基因Nrf2的表达增加。因此,本研究中促炎因子表达增高可能与激活氧化应激通路有关,相关机制有待进一步研究。

本实验经三质粒包装系统成功构建p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10慢病毒载体及高表达P62蛋白THP-1细胞株,为后续研究p62基因在感染性疾病中的作用提供了基础。