miR-27a靶向调控SFRP1对结直肠癌生物学行为的影响

司马学琴,苏延停,曾 智

流行病学研究[1]显示,结直肠癌作为胃肠道肿瘤疾病,其发病率和病死率逐年上升。目前,结直肠癌治疗常采用手术结合放化疗,但疗效有限[2-3]。寻找新的治疗靶点,抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移成为近年研究热点。微小RNA(miRNAs)是一组存在于真核生物中长度约为19～25个核苷酸的内源性非编码RNA,可与相关靶基因的3′端非翻译区结合,抑制其转录、翻译过程,发挥调控作用[4-5]。miR-27a作为miRNA的成员之一,位于19号染色体,具有多种生物学功能,参与了肿瘤的发生发展。既往研究[6]显示,miR-27a在乳腺癌中表达异常,与乳腺癌恶性程度和预后相关。研究[7]显示,miR-27a在结肠癌中表达上调,能增强结肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。分泌卷曲相关蛋白1(secreted frizzled-related protein 1,SFRP1)作为Wnt信号转导的负性调控者,在结直肠癌中表达下调[8]。miR-27a是否能通过靶向活化SFRP1从而抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移等过程尚不明确。该研究旨在探讨miR-27a在直肠癌中的表达,并分析其是否能够通过靶向调控SFRP1对直肠癌细胞生物学行为产生影响。

1 材料与方法

1.1 方法

1.1.1临床样本 取咸宁市中心医院2021年1月—12月行手术切除术的24例结直肠癌患者癌变组织和癌旁正常组织(距病变部位>5 cm处)于液氮中-70 ℃冻存备用。患者术前均未做任何形式的放化疗。所有患者均知情签署知情同意书,本研究由咸宁市中心医院伦理委员会审核批准(伦理批号:202011025)。

1.1.2主要材料 人结直肠癌细胞系HCT116购自中科院上海细胞库。胎牛血清(货号:12483020)和DMEM培养基(货号:11965092)购自美国Gibco公司;RT Master Mix(货号:FSQ-201)与SYBR Green Real-time PCR Master Mix(货号:QPK-201)购自东洋纺(上海)公司;抗体SFRP1(货号:ab126613)和Wnt4(货号:ab277798)购自Abcam(上海)贸易有限公司;抗体β-catenin(货号:AC106)、GAPDH(货号:AF1186)、辣根酶标记的山羊抗兔IgG(货号:A0208)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号:P0012)、SDS-聚丙烯酰胺试剂盒(货号:P0012AC)、0.25%胰蛋白酶(货号:C0201)、TRIzol(货号:R0016)和结晶紫染液(货号:C0121-100ml)购自上海碧云天生物技术有限公司;双荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号:G1701-100T)购自武汉塞维尔生物技术有限公司;Transwell小室(货号:354480)购自北京优尼康生物科技有限公司;miR-27a、SFRP1、U6内参引物,miR-27a模拟物(miR-27a mimic)、miR-27a抑制剂(miR-27a inhibitor)和阴性对照(negtive control,NC),SFRP1野生型和突变型的荧光素酶报告载体均购自苏州吉玛基因股份有限公司;LipofectaminTM2000(货号:11668030)转染试剂盒购自美国Invitrogen公司。

1.1.3 主要仪器CO2全湿度培养箱(型号:HHCP-160S)购自上海沃尔福实业有限公司;高速离心机(型号:TDI-16)购自上海医用分析仪器厂;实时荧光定量PCR仪(型号:CFX Connect)、垂直电泳槽(型号:1658033)、转膜仪(型号:Trans-Blot Turbo)购自美国BioRad公司;倒置荧光显微镜(CKX41)购自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养和转染 在恒温37 ℃及5%CO2的全湿度培养箱环境下,采用DMEM培养基(含10%胎牛血清)培养HCT116细胞。当细胞密度达到70%后,用0.25%胰蛋白酶消化,每孔1×105个细胞接种于6孔板中,根据LipofectamineTM2000转染试剂说明书及操作步骤,将miR-27a mimic(miR-27a mimics组)、miR-27a inhibitor(miR-27a inhibitor组)和NC(NC组)分别转染至HCT116细胞中,混匀,室温静置15 min,培养48 h,当培养基中HCT116细胞汇合度达到80%后收集各组细胞。

1.2.2MTT实验检测各组细胞增殖活性 取处于对数生长期的各组HCT116细胞,接种于48孔板中,每孔细胞设置为1×105个/ml,在恒温37 ℃、5%CO2条件下培养。分别在培养24、48、72和96 h后,各孔添加20 μl MTT溶液,孵育4 h后取上清液,与50 μl二甲基亚砜混溶。测定各孔细胞光密度(optical density,OD)值(酶标仪设置波长490 nm),计算细胞增殖情况。

1.2.3Transwell实验检测各组细胞侵袭、迁移情况 取处于对数生长期的各组HCT116细胞,0.25%胰蛋白酶进行消化,将细胞(1×105个)添加于Transwell上室中,细胞侵袭实验需要在Transwell中加入基质胶,而迁移实验无需加入基质胶。下室填充无血清DMEM培养基,培养24 h。吸去无血清培养基后,刮去上表面的贴壁细胞,多聚甲醛固定细胞,结晶紫染色,20 min后镜下取5个随机视野,对侵入小室的细胞进行计数,评估细胞侵袭、迁移情况。

1.2.4实时荧光定量PCR检测miR-27a和SFRP1 mRNA表达水平 使用TRIzol提取结直肠癌组织、癌旁正常组织和各组HCT116细胞中的总RNA,然后采用RT Master Mix逆转录试剂盒逆转录获得cDNA,用SYBR Green Real-time PCR Master Mix进行扩增,设置3个复孔测定miR-27a、SFRP1 mRNA表达水平。以U6为内参,miR-27a、SFRP1引物序列如表1所示。qRT-PCR反应体系20 μl(10 μl Mix、1 μl正向引物、1 μl反向引物、1 μl cDNA和 7 μl H2O),反应条件:95 ℃预变性3 min,95 ℃变性15 s,60 ℃退火30 s,60 ℃延伸30s;循环40次。测定结果采用2-ΔΔCT法计算各物质的相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5Western blot检测SFRP1、Wnt4、β-catenin蛋白表达 提取结直肠癌组织、癌旁正常组织和HCT116各处理组细胞中的蛋白。用BCA试剂盒测定蛋白浓度后,加入缓冲液进行沸水浴10 min。取20 μl样品(蛋白量45 μg)上样进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳,设置参数分离蛋白,湿法转膜,用5%脱脂奶粉封闭1 h,再分别加入用TBST溶液稀释的SFRP1(1∶10 00)、Wnt4((1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)、GAPDH(1∶5 00)抗体,4 ℃孵育过夜,加入辣根酶标记的山羊抗兔二抗(1∶5 000)室温孵育1 h后,洗膜3次,化学发光液显影,采用ImageJ软件分析蛋白条带灰度值。所有测定重复3次。

1.2.6TargetScan软件预测miR-27a与SFRP1的结合位点以及双荧光素酶实验报告实验 TargetScan在线软件预测miR-27a与SFRP1的3′UTR区域结合位点。构建突变型(SFRP1-MUT-3′UTR)质粒和野生型(SFRP1-WT-3′UTR)质粒。按照LipofectaminTM2000转染试剂盒说明,将突变型质粒分别与miR-27a mimic或NC共转染至HCT116细胞,将野生型质粒分别与miR-27a mimic或NC共转染至HCT116细胞,48 h后根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1 miR-27a和SFRP1在结直肠癌组织中的表达qRT-PCR检测结果如图1A所示,与癌旁正常组织相比,miR-27a在结直肠癌组织中高表达(t=7.624,P<0.05);而SFRP1 mRNA在结直肠癌组织中低表达(t=4.574,P<0.05)。Western blot结果如图1B所示,与癌旁正常组织相比,SFRP1在结直肠癌组织中低表达(t=3.013,P<0.05)。

图1 结直肠癌组织中miR-27a和SFRP1表达的比较

2.2 结直肠癌细胞中miR-27a上调和下调对SFRP1 mRNA水平的影响qRT-PCR检测结果显示,与NC组相比,miR-27a mimic组中miR-27a表达增加(t=6.332,P<0.05),miR-27a inhibior组中miR-27a表达下降(t=4.021,P<0.05),表明miR-27a mimic和miR-27a inhibior转染成功;与NC组相比,miR-27a上调后SFRP1 mRNA的表达水平降低(t=5.376,P<0.05),miR-27a下调后SFRP1 mRNA的表达水平提升(t=5.685、6.027,均P<0.05),提示miR-27a可能负向调控SFRP1。见图2。

图2 结直肠癌细胞中miR-27a上调和下调对SFRP1 mRNA水平的影响

2.3 miR-27a靶向作用SFRP1TargetScan软件显示miR-27a和SFRP1的3′UTR存在结合位点(如图3A所示)。双荧光素酶报告实验显示,与NC组(SFRP1野生型质粒和NC共转染)比较,SFRP1野生型质粒和miR-27a mimic共转染后,荧光素酶活性降低(t=4.921,P<0.05);而SFRP1突变型质粒和miR-27a mimic质粒共转染后,与NC组(SFRP1突变型质粒和NC共转染)比较,荧光素酶活性无差异(t=1.036,P>0.05),见图3B。提示miR-27a可靶向调控SFRP1表达。

图3 miR-27a对SFRP1的靶向调控作用

2.4 各组HCT116细胞增殖活性的比较MTT实验结果如图4所示,24 h后,各组细胞增殖活性有差异(F=63.207,P<0.01)。与NC组相比,miR-27a mimic组细胞增殖活性升高(t48 h=4.519,t72 h=5.582,t96 h=6.173,均P<0.05);与miR-27a mimic组相比,miR-27a inhibitor组细胞增殖活性降低(t48 h=8.836,t72 h=11.265,t96 h=9.357,均P<0.05)。

图4 各组细胞增殖情况的比较

2.5 各组HCT116细胞侵袭、迁移能力的比较Transwell小室侵袭实验结果如图5所示,与NC组(116.00±12.83)相比,miR-27a mimic组侵袭能力(158±15.67)提升(t=8.217,P<0.01);与miR-27a mimic组相比,miR-27a inhibitor组侵袭能力(82±9.75)降低(t=13.728,P<0.01)。此外Transwell小室迁移实验结果如图6所示,与NC组(249±12.37)相比,miR-27a mimic组迁移能力(305±16.78)提升(t=9.519,P<0.01);与miR-27a mimic组相比,miR-27a inhibitor组迁移能力(176±10.84)降低(t=17.352,P<0.01)。表明上调miR-27a可促进结直肠癌细胞的侵袭和迁移能力,下调miR-27a可抑制结直肠癌细胞的侵袭和迁移能力。

图5 各组细胞侵袭情况的比较

图6 各组细胞迁移情况的比较

2.6 miR-27a调控Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达Western blot结果如图7所示,与NC组比较,miR-27a mimic组SFRP1蛋白表达水平降低,而Wnt4和β-catenin蛋白表达水平升高(tSFRP1=3.252,tWnt4=3.827,tβ-catenin=5.185,均P<0.05);与miR-27a mimic组比较,miR-27a inhibitor组SFRP1蛋白表达水平升高,而Wnt4和β-catenin蛋白表达水平升高降低(tSFRP1=5.952,tWnt4=4.374,tβ-catenin=5.473,均P<0.05)。提示miR-27a可下调SFRP1表达,增加Wnt/β-catenin信号通路活性。

图7 Western blot检测SFRP1和Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的比较

3 讨论

我国结直肠癌发病率逐年递增,尤其是在中老年人群中,近年发病人数不断增加,严重威胁患者的生命健康。研究[9]表明,miRNA在恶性肿瘤的发生发展过程中通过参与多种细胞因子的转录和表达发挥重要作用。miRNA也通过类似途径诱导结直肠癌肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[10]。因此,抑制相关miRNA的活性成为近年结直肠癌治疗的新靶点,也为临床靶向治疗提供了新方向。

miR-27a在卵巢癌[11]、乳腺癌[12]、胃癌[13]中表达异常升高,具有一定的促癌作用。本研究结果显示,结直肠癌患者癌变组织中miR-27a 表达水平高于癌旁正常组织,提示miR-27a可能作为促癌因子发挥作用。

研究[14]表明SFRP1是miR-27a下游的作用靶点之一,miR-27a可抑制SFRP1活性,促进肿瘤细胞的增殖和侵袭迁移等。本研究显示结直肠癌组织中SFRP1 mRNA和蛋白表达水平均低于癌旁正常组,并在细胞水平评估了miR-27a inhibitor和miR-27a mimics的影响,结果显示,给予miR-27a mimic转染HCT116细胞后,SFRP1 mRNA表达下调;而HCT116细胞在转染miR-27a inhibitor后,SFRP1 表达增加。此外,荧光素酶报告基因实验进一步证明miR27-a能够靶向调控SFRP1。Qiao et al[15]研究发现miR-27a通过靶向SFRP1蛋白,调节Wnt/β-catenin信号通路,促进口腔鳞状癌细胞的上皮间质转化。为了进一步研究Wnt/β-catenin信号通路是否参与miR-27a在结直肠癌中的作用,本研究采用Western blot检测miR-27a上调和下调对HCT116细胞中Wnt4和β-catenin蛋白的影响,发现上调miR-27a后可靶向抑制SFRP1活性,激活了Wnt/β-catenin信号通路,促进肿瘤细胞的增殖和侵袭过程;下调miR-27a可靶向激活SFRP1,SFRP1上调可抑制Wnt4、β-catenin等信号分子蛋白的表达,相关的转录翻译过程被中断,肿瘤细胞增殖和侵袭过程被抑制,MTT和Transwell实验也证明miR27a能够促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移等生物学过程。

综上所述,下调miR-27a能靶向激活SFRP1活性,抑制结直肠癌细胞的增殖及侵袭等生物学过程,其主要是通过上调SFRP1,阻断下游的Wnt/β-catenin信号通路发挥抑癌作用。本研究为结直肠癌的临床治疗提供了新方向。后续将进一步结合动物实验,深入研究SFRP1在结肠癌中的作用机制。