lncRNA MALAT1通过调控miR-181a促进氧化应激模型中的心肌细胞损伤

郑丽华,王思瑶,李 鹏

急性心肌梗死(acute myocardial infraction,AMI)是一种以持续严重的心肌缺血所引起的心肌坏死为特征的缺血性心脏病[1-2]。众所周知,氧化应激在AMI的发生和进展中起着重要作用,其不仅能够影响心肌细胞内钙离子浓度,还能导致线粒体膜电位的降低和线粒体呼吸链的受损,进而导致细胞损伤甚至凋亡[3]。转移相关肺腺癌转录物1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)是一种长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA),最初作为肺癌转移的预后标志被发现[4]。研究[5-8]表明,MALAT1在多种肿瘤组织中高表达,并且可通过调控包括微小RNA-181a(microRNA-181a,miR-181a)在内的多种miRNAs参与肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和扩散等生物学行为。此外,MALAT1可通过调控内皮细胞功能、血管生长和氧化应激反应,参与多种心脏疾病的发展[8-12]。因此,该研究旨在探究MALAT1在AMI患者中的表达,并通过建立心肌细胞的氧化应激模型进一步揭示MALAT1对心肌细胞损伤的具体保护机制,以期阐明MALAT1作为治疗AMI生物靶点的潜在价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1临床样本来源 收集2021年5月—2022年10月至新疆医科大学第五附属医院心血管内科进行冠状动脉造影术以评估胸痛的30例AMI患者和30例健康的体检者的血清样本。联合使用胸前区疼痛、心电图ST段改变、血清肌钙蛋白Ⅰ含量以及冠状动脉造影结果进行AMI诊断。纳入标准为:① AMI组患者需符合AMI诊断标准;② 两组患者临床资料完整,且对本实验研究方法及目的知情同意。排除标准:① 合并有严重感染、肝炎、肝衰竭、终末期肾病、心肌病、先天性心脏及免疫、代谢系统疾病者;② 合并肿瘤或恶性疾病史者;③ 72 h内接受抗凝或溶栓治疗者;④ 未取得患者及其家属知情同意者。抽取两组人群肘静脉血7 ml,1 500 r/min离心10 min后取上层血清,保存于-20 ℃下以备后续使用。本研究经新疆医科大学第五附属医院医学伦理委员会审批(审批号:XJYK2021-37),所有患者均签署知情同意书。

1.1.2细胞系和主要试剂 人心肌细胞株AC16购自上海同科生物科技有限公司(货号TK2074);DMEM培养基,青-链霉素混合液,胎牛血清(美国Gibco公司,货号10704022、10335516、10403725);沉默MALAT表达的siRNA(si-MALAT)和阴性对照序列(si-NC),过表达或抑制miR-181a的miR-181a mimic和miR-181a inhibitor及其阴性对照序列miR-NC,野生型和突变型MALAT1片段(广州锐博生物技术有限公司,货号SIGS0010925-1、SIGS0016181-1、SIGS0017642-0、SIGW0026531-1、SIGW0026530-1);细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒(美国Abcam公司,货号:ab214730);RNA提取试剂盒、过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)、反转录试剂盒(北京天根生物科技有限公司,货号:DP209、DP015、DP1129);Lipofectamine 2000试剂(美国Invitrogen公司,货号:A24019);二喹啉甲酸(bicinchoninic acid assay,BCA)蛋白检测试剂盒,DAPI试剂,蛋白酶抑制剂和RIPA缓冲液(上海碧云天生物技术有限公司,货号:C11573、C01824、C11206、C13739);兔抗B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2),抗Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax),抗裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)和GAPDH抗体(武汉三鹰生物技术有限公司,货号:10119-1-AP、24197-1-AP、02197-1-AP、21495-1-AP)。HRP标记的山羊抗兔IgG,SYBR-Green qRT-PCR试剂盒,增强型ECL试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,货号:P805、P316、P720);Triton X-100试剂(北京雅安达生物技术有限公司,货号:9002-93-1);TUNEL试剂盒(瑞士Roche公司,货号:900127); pmirGLO质粒,荧光素酶报告系统(美国Promega公司,货号:E2269、G7901)。

1.1.3主要仪器 超净工作台(美国Thermo公司,型号:51029704);凝胶电泳仪、qRT-PCR仪(美国Bio-Rad公司,型号:X005-1、IO5);流式细胞仪FACS-Calibur (美国BD公司,型号:FACSC-Ⅱ);分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司,型号:752N);荧光显微镜(日本Olympus公司,型号:CZ51)

1.2 方法

1.2.1细胞培养和处理 使用含10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM培养基在37 ℃、5%CO2的培养箱中培养AC16细胞。采用H2O2处理AC16细胞建立心肌细胞氧化应激模型。使用不同浓度(0、50、150和200 μmol/L)的H2O2处理AC16细胞12 h以筛选最佳处理浓度。采用筛选出的最佳处理浓度(200 μmol/L)的H2O2处理AC16细胞0、4、8和12 h以筛选最佳处理时间。

1.2.2细胞转染和分组 取生长状态良好的AC16细胞分为:正常培养的对照(ctl)组,H2O2处理AC16细胞(H2O2组),H2O2处理转染si-NC或si-MALAT细胞的H2O2+si-NC组和H2O2+si-MALAT组,H2O2处理si-MALAT和 miR-NC共转染的H2O2+si-MALAT+miR-NC组,H2O2处理si-MALAT和miR-181a inhibitor共转染的H2O2+si-MALAT+miR-181a inhibitor组。将si-MALAT或miR-181a inhibitor及其相应的阴性对照序列参考Lipofectamine 2000试剂说明书转染入细胞中,转染24 h后,用200 μmol/L的H2O2处理AC16细胞12 h,随后进行后续检测。

1.2.3qRT-PCR检测MALAT和miR-181a的表达水平 按照RNA提取试剂盒说明书方法提取两组患者血清和上述各组AC16细胞中的总RNA。采用分光光度计在260/280 nm处检测提取的RNA的浓度与纯度。使用反转录试剂盒将上述RNA逆转录为cDNA,再采用SYBR-Green试剂盒进行qRT-PCR反应。以GAPDH或U6为内参,2-ΔΔCT方法计算待测细胞中MALAT和miR-181a的表达。本研究中使用的引物序列如表1所示。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.4荧光素酶基因报告实验 使用lncBase在线预测数据库(http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=lncBase/index)预测MALAT1与miR-181a之间可能的结合位点。为探究MALAT1与miR-181a之间的相关性,将野生型和突变型MALAT1片段分别插入pmirGLO质粒的Nhe I和Sal I之间,简称MALAT1-WT和MALAT1-MUT,并将其与miR-181a mimic或miR-NC共转染入AC16细胞。转染48 h后裂解细胞,用荧光素酶报告分析系统检测各组AC16细胞中荧光素酶活性。

1.2.5CCK-8法检测细胞增殖活力 取各组AC16细胞,按2×104/孔接种至96孔板中,置于37 ℃、5%CO2的培养箱孵育24 h后,每孔加入10 μl的CCK-8试剂,继续孵育4 h后,在分光光度计450 nm处测定每孔吸光度值。

1.2.6TUNEL法检测细胞凋亡 取各组AC16细胞,采用0.1% Triton X-100透化细胞载玻片,按照TUNEL试剂盒说明书方法加入TUNEL试剂,37 ℃避光孵育30 min后加入DAPI试剂染核,再次避光孵育5 min后,在荧光显微镜下进行观察,并在高倍视野下拍照。TUNEL阳性细胞率=TUNEL染色阳性数/细胞总数×100%。

1.2.7Western blot实验检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3的表达 取各组AC16细胞,采用蛋白酶抑制剂和RIPA缓冲液提取细胞内总蛋白。BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。利用SDS-PAGE将蛋白样品进行分离后转移至聚偏二氟乙烯膜上。5%脱脂奶粉阻断抗体后加入稀释后的一抗,具体为:Bcl-2(1∶2 000),Bax(1∶2 000),cleaved caspase 3 (1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000),4 ℃孵育过夜后,加入HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶10 000)作为二抗,室温下孵育2 h。最后采用增强型ECL试剂盒在凝胶成像系统中进行显影,ImageJ软件分析条带灰度值。

1.3 统计学处理采用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析。所有数据均以均数±标准差表示。两组间比较使用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,各组间比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MALAT1与miR-181a在两组受试者中的表达情况及相关性分析AMI组平均年龄(55.10±4.22)岁,男/女=19/11;Normal组的平均年龄(56.24±3.59)岁,男/女=20/10。两组患者在年龄和性别比例方面的差异均无统计学意义(t=2.46、3.52,P=0.55、0.71)。qRT-PCR检测结果显示,与Normal组相比,MALAT1在AMI组患者外周血样本中的表达水平升高(t=33.57,P=0.019),而miR-181a的表达水平降低(t=22.68,P=0.036)(图1A、B)。相关分析的结果显示,在AMI患者外周血样本中MALAT1表达和miR-181a表达呈负相关(r=-0.605,P<0.01)(图1C)。上述结果表明,MALAT1和miR-181a可能参与AMI的发病机制。

图1 两组受试者中MALAT1与miR-181a表达水平的比较以及AMI患者MALAT1与miR-181a的相关系分析

2.2 H2O2对心肌细胞中MALAT1和miR-181a表达的影响qRT-PCR检测结果显示,与0 μmol/L组相比,在不同浓度H2O2处理下,AC16细胞中MALAT1的表达水平明显升高,且呈浓度和时间依赖性(F=73.09,P<0.05),且当以200 μmol/L H2O2处理AC16细胞时,MALAT1表达水平呈升高趋势(F=63.29,P<0.05)(图2A、B)。而AC16细胞中miR-181a的表达水平则随着H2O2处理浓度与时间的增加呈降低趋势(F=55.60,P<0.05)(图2C、D)。

图2 不同浓度H2O2处理以及200 μmmol/L不同时间H2O2处理下心肌细胞中MALAT1和miR-181a表达

2.3 MALAT1靶向调控miR-181a表达lncBase在线预测数据库预测显示,MALAT1与miR-181a之间存在潜在结合位点(图3A)。双荧光素酶基因报告实验结果显示,与共转染miR-NC和MALAT1-WT的AC16细胞相比,共转染miR-181a mimic和MALAT1-WT的细胞中荧光素酶活性降低(LSD-t=3.41,P<0.05);而转染MALAT1-MUT后,共转

图3 MALAT1靶向调控miR-181a表达的分析和各组AC16细胞中MALAT1与miR-181a的比较

染miR-NC或miR-181a mimic的细胞中荧光素酶活性差异均无统计学意义(LSD-t=1.67,P>0.05)(图3B)。qRT-PCR检测结果显示,与ctl组相比,H2O2组、H2O2+si-NC组和H2O2+si-MALAT1组中MALAT1表达均升高(LSD-t=44.59、27.31、30.15,P<0.05),而miR-181a表达均降低(LSD-t=11.26、19.83、10.34,P<0.05);与H2O2组相比,H2O2+si-MALAT1组中MALAT1表达降低(LSD-t=38.60,P<0.05),miR-181a表达升高(LSD-t=71.25,P<0.05),而H2O2+si-NC组中MALAT1与miR-181a表达均无明显改变(LSD-t=1.29、2.25,P>0.05)(图3C、D)。上述实验结果表明,在心肌细胞中MALAT1可靶向调控miR-181a表达。

2.4 下调MALAT1对H2O2诱导的心肌细胞损伤的影响CCK-8法检测结果显示,与ctl组相比,H2O2组、H2O2+si-NC组和H2O2+si-MALAT1组中AC16细胞的细胞活力均降低(LSD-t=36.71、27.35、7.29,均P<0.05);与H2O2组相比,H2O2+si-MALAT1组细胞活力升高(LSD-t=6.74,P<0.05),而H2O2+si-NC组无明显改变(LSD-t=0.52,P>0.05)(图4)。TUNEL染色结果显示,与ctl组相比,H2O2组、H2O2+si-NC组和H2O2+si-MALAT1组中AC16细胞的TUNEL阳性率均增加(LSD-t=20.12、17.48、44.10,P<0.05);与H2O2组相比,H2O2+si-MALAT1组的TUNEL阳性率降低(LSD-t=13.19,P<0.05),H2O2+si-NC组无明显改变(LSD-t=2.17,P>0.05)(图5);Western blot检测结果显示,与ctl组相比,H2O2组、H2O2+si-NC组和H2O2+si-MALAT1组AC16细胞中促凋亡蛋白cleaved caspase-3和Bax表达水平均升高(LSD-t=38.64、20.41、41.73、22.10、10.52、14.23,P<0.05),凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达水平降低(LSD-t=13.14、13.49、7.59,P<0.05);与H2O2组相比,H2O2+si-MALAT1组中cleaved caspase-3和Bax蛋白表达水平降低(LSD-t=26.05、19.41,P<0.05),而Bcl-2的蛋白表达水平升高(LSD-t=15.22,P<0.05),H2O2+si-NC组中上述蛋白表达均无明显改变(LSD-t=1.17、0.62、2.58,P>0.05)(图6)。上述结果提示沉默MALAT1可以部分逆转H2O2作用下的心肌细胞损伤。

图4 各组心肌细胞的增殖活力的比较

图5 各组心肌细胞凋亡的比较 ×400

图6 各组细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白表达水平的比较

2.5 抑制miR-181a表达对下调MALAT1在H2O2诱导的心肌细胞损伤中的作用与ctl组相比,转染miR-181a inhibitor的AC16细胞中miR-181a的表达水平降低(LSD-t=16.49,P<0.01),而转染miR-NC的细胞中miR-181a的表达水平差异无统计学意义(LSD-t=2.10,P>0.05)(图7A)。与ctl组相比,H2O2组、H2O2+si-MALAT1组、H2O2+si-MALAT1+miR-NC组和H2O2+si-MALAT1+miR-181a inhibitor组中的AC16细胞活力均降低

图7 抑制miR-181a表达对各组心肌细胞增殖活力的影响

图8 抑制miR-181a表达对各组心肌细胞凋亡的影响 ×400

(LSD-t=19.11、8.64、7.94、20.73,P<0.05),而TUNEL阳性率均升高(LSD-t=19.30、9.12、8.26、17.18,P<0.05);与H2O2组相比,H2O2+si-MALAT1组和H2O2+si-MALAT1+miR-NC组中细胞活力升高(LSD-t=8.64、8.43,P<0.05),TUNEL阳性率降低(LSD-t=7.72、8.10,P<0.05),H2O2+si-MALAT1+miR-181a inhibitor组差异无统计学意义(LSD-t=2.27、1.28,P>0.05);与H2O2+si-MALAT1组相比,H2O2+si-MALAT1+miR-181a inhibitor组细胞活力降低(LSD-t=9.84,P<0.05),TUNEL阳性率升高(LSD-t=10.36,P<0.05),H2O2+si-MALAT1+miR-NC组差异无统计学意义(LSD-t=1.15、0.29,均P>0.05)(图7B、8);与ctl组相比,H2O2组、H2O2+si-MALAT1组、H2O2+si-MALAT1+miR-NC组和H2O2+si-MALAT1+miR-181a inhibitor组细胞中cleaved caspase-3和Bax蛋白表达水平均升高(LSD-t=13.04、8.51、9.60、12.46、12.25、7.14、7.19、12.90,均P<0.05),Bcl-2的表达水平降低(LSD-t=12.16、7.24、8.72、13.29,均P<0.05);与H2O2组相比,H2O2+si-MALAT1组,H2O2+si-MALAT1+miR-NC组中cleaved caspase-3和Bax表达水平降低(LSD-t=8.23、9.28、8.09、8.94,均P<0.05),Bcl-2的表达水平升高(LSD-t=10.71、11.05,P<0.05),而H2O2+si-MALAT1+miR-181a inhibitor组中上述蛋白表达均无明显改变;与H2O2+si-MALAT1组相比,H2O2+si-MALAT1+miR-181a inhibitor组细胞cleaved caspase-3和Bax蛋白表达水平升高(LSD-t=47.56、62.05,P<0.05),Bcl-2的表达水平降低(LSD-t=15.21,P<0.05),H2O2+si-MALAT1+miR-NC组无明显改变(图9)。上述结果提示沉默MALAT1可通过促进细胞中miR-181a表达从而降低H2O2对心肌细胞的损伤作用。

3 讨论

本研究通过体内外实验探讨MALAT1在AMI中的作用及相关分子机制,结果表明,与正常对照人群相比,MALAT1在AMI患者中的表达上调。miR-181a在癌症的发生中具有重要作用[13]。研究[14]表明,miR-181a可通过激活蛋白激酶B,促进其下游蛋白内皮型一氧化氮合酶的磷酸化,从而抑制心肌细胞凋亡,缓解缺血再灌注诱导的心肌细胞损伤。这表明miR-181a可能参与心肌梗死的发生。在本研究中结果显示,与正常对照人群相比,AMI患者中miR-181a的表达降低,且在AMI患者中,MALAT1与miR-181a表达水平呈负相关。在胃癌中的研究[7]显示 MALAT1可负向调控miR-181a-5p表达参与肿瘤的发生与进展。这提示,在AMI的发病中MALAT1也可能通过调控miR-181a参与心肌细胞的损伤。研究[1]表明,氧化应激是AMI后心肌损伤的重要原因。当发生心肌缺血时,细胞内产生大量的自由基,从而使心肌细胞产生氧化应激,导致细胞受损。因此,本研究利用H2O2建立心肌细胞氧化应激模型进行探究,结果显示,MALAT1在H2O2刺激下的AC16细胞中高表达,而miR-181a表达下调。这进一步提示MALAT1和miR-181a可能参与心肌细胞损伤。本研究生物信息学软件预测也显示miR-181a与MALAT1的3＇UTR区存在结合位点,双荧光素酶基因报告实验进一步验证了它们之间的相互作用关系。此外,qRT-PCR实验结果也表明MALAT1可负向调控miR-181a的表达。这证明MALAT1可与miR-181a相互作用来参与心肌细胞损伤。

心肌细胞凋亡是AMI的重要病理特征,故降低心肌细胞的凋亡水平是治疗心肌细胞损伤的重点[15]。本研究结果表明,下调MALAT1表达可抑制心肌细胞的凋亡,并降低促凋亡蛋白cleaved caspase-3和Bax的表达水平,而促进凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达。功能挽救实验结果表明,抑制miR-181a表达可抵消下调MALAT1对心肌细胞的保护作用,促进凋亡蛋白cleaved caspase-3和Bax的表达,抑制Bcl-2的表达。这一结果显示,MALAT1对心肌细胞凋亡的影响是由miR-181a介导的。进一步证明MALAT1与miR-181a相互作用共同参与心肌细胞损伤。

综上所述,本研究表明,MALAT1/miR-181a轴在调节心肌细胞损伤中具有重要作用。MALAT1基因敲除可能通过促进miR-181a表达而减轻心肌细胞损伤,提示MALAT1可能是AMI后心肌细胞损伤的潜在靶点。然而,本研究患者规模有限,大多数机制研究是在H2O2诱导的细胞中建立的。后期仍需在大规模的患者样本中来证实MALAT1/miR-181a轴的作用,且需在动物模型中验证其作为AMI的治疗靶点的潜力。