基于生物信息学筛选与胶质母细胞瘤预后及免疫相关的铁死亡基因

孙 皓,赵志娟,孟 莲,刘春霞,3

2021年WHO根据临床特点及分子病理学特征把胶质瘤分为成人型弥漫性胶质瘤和儿童型弥漫性胶质瘤,其中成人型弥漫性胶质瘤又分为:① 星形细胞瘤,IDH突变型;② 少突胶质细胞瘤,IDH突变和1p/19q共缺失型;③ 胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM),IDH野生型[1]。GBM是成人中最多见并且侵袭能力最强的恶性胶质瘤,治疗效果较差,患者中位总生存期小于15个月[2]。因此,探究GBM的分子机制,寻找分子靶标具有重要意义。铁死亡是新近报道的一种程序性细胞死亡模式,与其他死亡模式不同,其主要由于细胞内脂质活性氧生成量和细胞对其降解能力失衡所致,诱导肿瘤细胞铁死亡有望成为一种新的肿瘤治疗方法[3]。

目前GBM中铁死亡的机制研究尚处于初期阶段,本研究利用生物信息学结合实验验证,将GBM差异表达基因与铁死亡基因进行比对,构建GBM中铁死亡相关差异表达基因的蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)网络,并从表达差异、预后影响以及免疫浸润等角度对网络中的枢纽基因进行分析,为研究GBM中铁死亡的分子机制提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器正常星形胶质细胞HA1800及胶质细胞培养基(上海美湾生物科技有限公司,货号:M1013),胶质母细胞瘤细胞系A172(武汉普诺赛生命科技有限公司,货号:CL-0012),胶质母细胞瘤细胞系U251MG(上海中科院细胞库,目录号:TCHu58),DMEM培养基(美国GIBCO,货号:C3113-0500),胎牛血清(上海逍鹏生物科技有限公司VivaCell,货号:C04001-500),青-链霉素混合物、1×Phosphate Buffered Solution缓冲液、胰蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司,货号:P1400、P1020、T1320),TRIzol试剂、反转录试剂盒(美国ThermoFisher公司,货号:15596026、K1622),实时荧光定量PCR的预混体系(江苏康为世纪生物科技股份有限公司,货号:CW2601H),二氧化碳培养箱、实时荧光定量PCR仪(美国ThermoFisher公司,型号:3140、4351106),倒置显微镜(日本OLYMPUS,型号:DP74),PCR扩增仪(美国 Bio-Rad公司,型号:C1000)。

1.2 方法

1.2.1筛选GBM铁死亡相关差异表达基因 选取Gene Expression Omnibus(GEO)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)中GSE108474数据集(包含221例GBM样本和28例正常脑组织样本),使用GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)数据集进行差异基因筛选,并以P<0.05且|log FC|>1为筛选标准,获得GBM差异表达基因。使用GraphPad Prism 9软件绘制火山图。从铁死亡数据库FerrDb(http://www.zhounan.org/ferrdb)中下载铁死亡相关基因(网站中铁死亡相关调控基因数据来自PubMed数据库中的784篇铁死亡相关文献)。通过韦恩图网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)将GBM差异表达基因与铁死亡基因进行比对,获取GBM中铁死亡相关差异表达基因。

1.2.2差异基因的GO和KEGG分析 利用在线工具网站DAVID(https://david.ncifcrf.gov)对上述获得的基因进行GO功能和KEGG通路富集分析,其中GO分析包括细胞组分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)、生物过程(biological process,BP)三个部分。

1.2.3构建差异表达基因PPI网络和筛选网络中枢纽基因 使用在线分析网站String(https://cn.string-db.org)预测并创建GBM中铁死亡相关差异表达基因的PPI网络,并利用Cytoscape 3.8.2软件进行可视化分析,使用CytoHubba插件,按照“Degree”值选出PPI网络中的前10名的枢纽基因。

1.2.4使用TIMER网站进行生存和免疫浸润分析 使用在线分析网站TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)对PPI网络中的枢纽基因进行生存预后分析,绘制Kaplan-Meier曲线。并利用TIMER网站分析影响GBM患者预后的枢纽基因与多种免疫细胞(如肿瘤中B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、树突状细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞)浸润水平的相关性。

1.2.5使用GEPIA网站进行基因的表达量分析和相关性分析 基因分析网站GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)中收集整理了来自TCGA和GTEx这两大数据库中大量的肿瘤样本RNA-seq数据,本研究首先利用GEPIA网站来分析影响预后枢纽基因在正常脑组织和GBM中的表达水平,再使用网站中基因相关性分析工具验证GBM中影响预后枢纽基因与铁死亡调节因子是否具有相关性。

1.2.6使用HPA数据库进行蛋白表达分析 利用HPA(https://www.proteinatlas.org)数据库中收集整理的蛋白组学、转录组学以及生物信息学数据,比较影响GBM患者预后的枢纽基因在正常脑组织和高级别胶质瘤组织中的蛋白表达水平。

1.2.7使用TISIDB数据库进行肿瘤免疫特征相关性分析 利用肿瘤免疫分析数据库TISIDB(http://cis.hku.hk/TISIDB/index.php)分析PPI网络中影响GBM患者预后的枢纽基因与趋化因子、趋化因子受体、免疫抑制剂和免疫刺激剂等分子的相关性。

1.2.8细胞培养 将HA1800细胞接种至胶质细胞培养基中,待生长至80%～90%时,按照1∶2的比例进行细胞传代处理,待细胞状态稳定后用于实验。将胶质母细胞瘤细胞系A172和U251MG细胞接种至DMEM培养基中(包含10%血清和1%青-链霉素混合液),待生长至80%～90%时,按照1∶3的比例进行细胞传代处理,待细胞状态稳定后(第3代以后)用于实验。

1.2.9实时荧光定量PCR比较细胞中影响患者预后枢纽基因的mRNA表达水平 使用TRIzol法提取细胞的总RNA,并在定量后使用反转录试剂盒将提取的RNA逆转录成cDNA。PCR实验的20 μl反应体系为正反向引物各0.5 μl,2 μl样本cDNA、10 μl 实时荧光定量PCR的预混体系以及7 μl无酶水。GAPDH为内参,每组3个副孔,实验重复3次,结果数据以2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。引物序列:GAPDH正向5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′,反向5′-TTGATTTTGGAGGGA-TCTCG-3′;CD44正向5′-ATAATAAAGGAGCAGCACTTCAGGA-3′,反向5′-ATAATTG-TGTCTTGGTCTCTGGTAGC-3′;MDM2正向5′-TGCCAAGCTTCTCTGTGAA-3′,反向5′-CGATGATTCCTGCTGATTGA-3′;STAT3正向5′-CCTTTGGAACGAAGGGTACA-3′,反向5′-CGGACTGGATCTGGGTCTTA-3′。结果使用GraphPad Prism 8.0进行统计分析和作图。

1.3 统计学处理差异基因筛选使用GEO2R进行统计分析。实时荧光定量PCR结果两组间表达量差异的比较使用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GBM中铁死亡相关差异表达基因的筛选结果从GSE108474数据集中获得5 331个差异基因(见图1A)。从铁死亡数据库FerrDb网站下载铁死亡相关基因484个,按照基因在铁死亡过程中发挥的不同作用分为促进铁死亡的“Driver”基因264个,抑制铁死亡的“Suppressor”基因238个,以及标记铁死亡发生的“Marker”基因9个。将差异表达基因与铁死亡相关基因取交集后,筛选出114个与铁死亡相关的差异基因(见图1B),其中包含59个促进铁死亡的“Driver”基因,57个抑制铁死亡的“Suppressor”基因以及2个标记铁死亡发生的“Marker”基因(见图1C)。

图1 GBM差异表达基因及铁死亡相关基因

2.2 差异基因GO和KEGG富集分析结果在DAVID数据库中对获得的114个基因进行GO和KEGG分析(见图2)。GO功能注释分析结果表明,BP功能富集包括负调控神经元死亡、正调控基因表达、正调控RNA聚合酶Ⅱ启动子转录等。CC功能富集包括胞浆、细胞质、核等。MF功能富集包括蛋白结合、可识别蛋白结合、DNA结合等。KEGG分析结果显示,筛选出的GBM铁死亡相关差异表达基因参与了铁死亡和自噬-动物等通路。

图2 114个铁死亡相关差异表达基因的GO和KEGG分析结果

2.3 PPI网络分析结果通过String网站构建了114个铁死亡相关差异表达基因的PPI网络,经Cytoscape软件可视化处理之后,得到由90个基因构成的互作网络(见图3A)。使用Cytohubba插件以Degree值为标准,筛选出连接度较高的前10个枢纽基因(见图3B),分别为雄激素受体(androgen receptor,AR)、双微体2(murine double minute 2,MDM2)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白1基因(cAMP responsive element binding protein 1 gene,CREB1)、糖原合成酶激酶3B(glycogen synthase kinase 3B,GSK3B)、信号转导因子和转录激活因子3

图3 114个铁死亡相关差异表达基因构成PPI网络及10个枢纽基因

(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、磷脂酰肌醇激酶-3催化亚基α基因(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha gene,PIK3CA)、细胞黏附分子44(cluster of differentiation 44,CD44)、SRC酪氨酸激酶(src tyrosine kinase,SRC)和MYCN 原癌基因(MYCN proto-oncogene,MYCN)。

2.4 10个枢纽基因与GBM患者预后相关性分析利用TIMER基因分析网站对10个枢纽基因进行了生存分析,Kaplan-Meier曲线显示,CD44(Log-rankP=0.003)、MDM2(Log-rankP=0.012)和STAT3(Log-rankP=0.003)的表达量与GBM患者的生存预后相关(图4),基因高表达的GBM患者的累积生存率低。

图4 GBM中10个枢纽基因的预后分析结果

2.5CD44、MDM2和STAT3表达量在GBM与正常脑组织间的比较运用GEPIA数据库对CD44、MDM2和STAT3这3个基因进行表达量分析验证,将GBM与正常脑组织进行对比,结果显示3个基因在GBM中的表达均高于正常脑组织(均P<0.05)(见图5)。

图5 CD44、MDM2和STAT3在GBM与正常脑组织中表达量的比较

2.6 GBM和HA1800细胞中CD44、MDM2和STAT3的mRNA表达比较结果使用实时荧光定量PCR分别检测CD44、MDM2和STAT3在正常星形胶质细胞(HA1800)和GBM细胞(A172和U251MG)中的mRNA表达情况。结果显示,CD44、MDM2、STAT3在A172和U251MG细胞中的mRNA表达高于HA1800(t=17.970、9.462、8.080、8.721、15.790、12.880,均P<0.05)。见图6。上述结果表明,CD44、MDM2和STAT3在GBM细胞中的mRNA表达高于正常星形胶质细胞。

图6 CD44、MDM2和STAT3在HA1800、A172和U251MG细胞中表达量的比较

2.7 高级别胶质瘤和正常脑组织中CD44、MDM2和STAT3的蛋白表达比较结果为了进一步研究CD44、MDM2和STAT3在GBM中的蛋白表达水平,在HPA数据库分别对3个基因进行检索(见图7)。结果显示,CD44、MDM2和STAT3在高级别胶质瘤中蛋白阳性表达程度高于正常脑组织。

图7 HPA数据库中CD44、MDM2和STAT3在高级别胶质瘤和正常脑组织中蛋白表达的情况 ×200

2.8 GBM中CD44、MDM2和STAT3与铁死亡的相关性为验证CD44、MDM2和STAT3在GBM中是否影响铁死亡,利用GEPIA数据库分别在GBM中分析这3个基因与铁死亡调节因子的相关性。结果显示,CD44的表达与铁死亡负调控因子铁蛋白重链1(ferritin heavy chain 1,FTH1)、血红素结合蛋白1(heme binding protein 1,HEBP1)和细胞凋亡诱导因子线粒体相关2(apoptosis inducing factor mitochondria associated 2,AIFM2)呈正相关;STAT3的表达与铁死亡负调控因子溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)、HEBP1和AIFM2呈正相关;MDM2的表达与铁死亡正调控因子核受体共激活因子 4(nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)和酰基辅酶 A 合成酶长链家族成员 4(acyl-CoA synthetase long chain family member 4,ACSL4)呈负相关。见图8。以上结果表明,在GBM中CD44、MDM2和STAT3均与铁死亡呈负相关。

图8 GBM中CD44、MDM2和STAT3与铁死亡调控因子的相关性分析

2.9CD44、MDM2和STAT3基因表达水平与GBM中免疫细胞浸润水平的相关性利用TIMER网站对3个基因进行免疫浸润分析,以此来预测各基因与GBM中免疫成分浸润的相关性。结果显示,肿瘤中CD44基因表达升高时,CD4+T细胞、嗜中性粒细胞及树突状细胞也会增多,而肿瘤纯度、B细胞及CD8+T细胞的浸润水平将会降低(均P<0.05);MDM2基因高表达时,CD8+T细胞和树突状细胞的浸润水平升高,肿瘤纯度和巨噬细胞的浸润将减少(均P<0.05);当STAT3高表达时,CD4+T细胞、嗜中性粒细胞及树突状细胞的浸润会增多,而

肿瘤纯度及CD8+T细胞的浸润将减少(均P<0.05)。见图9。

图9 TIMER数据库分析基因表达与免疫浸润的相关性分析

2.10CD44、MDM2和STAT3基因表达与免疫特征的相关性通过TISIDB数据库分析GBM中CD44、MDM2和STAT3的表达水平与免疫细胞趋化因子或受体之间的相关性。结果显示如图10 所示,多种趋化因子和趋化因子受体与GBM中CD44、MDM2和STAT3的表达相关。CD44的表达与趋化因子配体2(C-C motif chemokine ligand 2,CCL2)、CXC基序趋化因子配体(C-X-C motif chemokine ligand,CXCL)3和CCL20等趋化因子呈正相关(r=0.643、0.659、0.569,均P<0.01),并与CC基序趋化因子受体1(C-C motif chemokine receptor,CCR)1、CCR5和CCR2等趋化因子受体呈正相关(r=0.502、0.519、0.445,均P<0.01);MDM2的表达与趋化因子配体(C-C motif chemokine ligand,CCL)7、CXCL10和CCL26等趋化因子呈正相关(r=0.305、0.242、0.257,均P<0.01),并与CCR2、CXC基序趋化因子受体(C-X-C motif chemokine receptor 3,CXCR)3及CXCR6等趋化因子受体呈正相关(r=0.250、0.206、0.212,均P<0.01);STAT3的表达与趋化因子配体14(C-C motif chemokine ligand 14,CCL14)和趋化因子配体19(C-C motif chemokine ligand 19,CCL19)呈负相关(r=-0.155、-0.208,均P<0.05),与CC基序趋化因子受体10(C-C motif chemokine receptor 10,CCR10)、CC基序趋化因子受体(C-C motif chemokine receptor,CCR1)1及CCR5等趋化因子受体呈正相关(r=0.322、0.359、0.333,均P<0.01)。

图10 TISIDB数据库分析基因表达与免疫分子的相关性

此外,CD44、MDM2和STAT3与GBM中各种免

疫抑制剂和免疫刺激剂的相关性分析结果显示,CD44与含V区域T细胞激活抑制因子1、腺苷A2a受体及CD160分子(CD160 molecule,CD160)等免疫抑制剂呈现负相关(r=-0.338、-0.281、-0.325,均P<0.01),与免疫刺激剂TNF超家族成员14、CXCR4及白细胞介素-6等呈正相关(r=0.526、0.444、0.509,均P<0.01);MDM2与免疫抑制剂白介素10受体亚基β和半乳糖凝集素9等呈正相关(r=0.339、0.205,均P<0.01),与VTCN1(r=-0.188,P<0.05)呈负相关,与CD28分子和TNF 超家族成员13等免疫刺激剂呈正相关(r=0.344、0.284,均P<0.01);STAT3的表达与免疫抑制剂CD160、淋巴细胞活化基因3及VTCN1等呈负相关(r=-0.397、-0.19、-0.282,均P<0.05),与CD276分子、白细胞介素 6 受体和PVR细胞粘附分子等免疫刺激剂呈正相关(r=0.448、0.431、0.430,均P<0.01)。以上这些结果说明CD44、MDM2和STAT3在GBM免疫微环境中发挥调节作用。

3 讨论

由于GBM侵袭能力强且易复发,目前临床上GBM的治疗效果较差,随着对GBM研究的不断深入,陆续发现了一些新的治疗方法,如纳米技术治疗、脉冲消融疗法等[4]。近几年研究[5]发现某些基因或物质可以通过激活铁死亡抑制GBM的进展。

本研究在5 331个GBM差异表达基因中确定了114个铁死亡相关基因。KEGG分析显示,114个基因除了在铁死亡通路上富集之外,还在自噬-动物通路上富集。目前铁死亡与自噬这两种死亡模式之间的相关性研究越来越多,提出铁死亡是一种自噬依赖性的细胞死亡过程[3]。本研究筛选出的铁死亡相关差异表达基因可能是GBM中连接自噬与铁死亡的关键基因。

本研究从114个基因构成的PPI网络中筛选出10个枢纽基因,并发现其中CD44、MDM2和STAT3的高表达的GBM患者生存率更低。研究[6]显示,STAT3的表达可以诱导GBM干细胞的分化并促进成瘤;在GBM中下调MDM2的表达后,肿瘤进展受到抑制[7];研究显示[8]下调CD44的表达后,GBM细胞的增殖和迁移能力减弱。上述结果说明,CD44、MDM2和STAT3的表达促进了GBM的进展。

另有研究[9]显示,下调STAT3的表达可以促进胃癌细胞铁死亡,延缓胃癌进展;抑制MDM2的表达可以增强结直肠癌细胞对铁死亡诱导剂的敏感性,进而抑制肿瘤发展[10];抑制CD44的表达也可以促进结直肠癌细胞的铁死亡[11]。虽然目前在GBM中缺乏CD44、MDM2和STAT3与铁死亡的相关报道,但本研究通过生物信息学方法,发现CD44、MDM2和STAT3的表达抑制了GBM细胞的铁死亡,这为接下来的具体机制研究提供新思路。

肿瘤细胞的发展及转移与肿瘤微环境密切相关,其中免疫细胞的浸润是肿瘤微环境变化的重要影响因素。本研究发现CD44、MDM2和STAT3在GBM中与多种免疫细胞的浸润呈现出不同程度的相关性,其中CD44、STAT3的表达与CD4+T细胞、噬中性粒细胞和树突状细胞的浸润水平呈正相关,MDM2的表达与CD8+T细胞和树突状细胞的浸润水平呈正相关。研究[12]显示,GBM中CD4+T细胞和CD8+T细胞浸润水平的升高改善了患者预后,而中性粒细胞-淋巴细胞与GBM患者的不良预后相关[13]。上述结果提示,CD44、MDM2和STAT3可能是连接铁死亡和肿瘤免疫疗法的关键分子。

趋化因子及趋化因子受体是介导免疫细胞浸润至肿瘤组织内的关键分子,本研究发现CD44、MDM2和STAT3的表达与多种趋化因子及受体的表达相关。这些趋化因子及受体的表达影响着微环境的改变,例如CCL2-CCR2信号通路在肝细胞癌中可以招募单核巨噬细胞和髓源性抑制细胞进入肿瘤微环境,并抑制肿瘤相关抗原特异性CD8+T细胞的活化[14];CXCL3具有促进肿瘤中血管生成的作用,而CXCL10具有抑制血管生成的作用[15]。此外,本研究还发现CD44、MDM2和STAT3可以影响某些免疫抑制剂和免疫刺激剂的表达。上述结果提示,CD44、MDM2和STAT3可能在肿瘤免疫微环境中发挥调节作用。

本研究将生物信息学与细胞实验结合,在GBM中筛选出CD44、MDM2和STAT3这3个与铁死亡相关的、影响患者预后的异常高表达基因。CD44、MDM2和STAT3的表达也会影响肿瘤微环境中趋化因子和趋化因子受体的表达,并影响免疫细胞的浸润。综上所述,调节CD44、MDM2和STAT3的表达有望成为诱导肿瘤细胞铁死亡和免疫疗法的新方法。