面部激素依赖性皮炎患者外周血单一核细胞SOCS1、CKLF1的表达及祛风清热凉血方的疗效

成 娟,陈 宏,刘德华,冯 爽

(1.天津市人民医院皮肤科,天津 300121;2.晋城市人民医院皮肤科)

面部激素依赖性皮炎(FCDD)是由于长期在面部不当使用外用糖皮质激素而引起的慢性炎性反应疾病,具体发病机制目前尚未明确,但近期研究发现T辅助细胞(Th)亚群分化失衡所引起的皮肤免疫功能异常与FCDD发病关系密切,而细胞因子信号传导抑制因子1(SOCS1)与趋化素样因子1(CKLF1)在Th细胞免疫平衡中扮演了重要的角色。为了进一步探索SOCS1与CKLF1的作用和临床意义,本文研究了SOCS1与CKLF1 mRNA在FCDD患者PBMC中的表达,并观察祛风清热凉血方治疗热毒炽盛证FCDD患者的疗效及对两种细胞因子表达变化的影响,进而为祛风清热凉血方治疗FCDD机制的阐明提供理论基础。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取2015年3～12月天津市人民医院确诊为FCDD且中医辨证为热毒炽盛证患者50例为FCDD组,其中男8例,女42例,年龄18～62岁,平均(36.14 ±11.02)岁,对照组为同期正常体检的40例正常人,其中男13例,女27例,年龄18～64岁,平均(41.15±14.47)岁。两组性别、年龄比较,差异无统计学意义(P>0.05)。FCDD组口服祛风清热凉血方颗粒剂(方剂主要药物:生地黄、生石膏、水牛角、玄参、白鲜皮、知母、荆芥、防风、牛蒡子、金银花、连翘、白茅根、黄芩、黄柏、苦参、升麻、白芍、甘草,广东一方制药厂生产),每日1剂,冲服。口服药物同时给予0.9 %生理盐水冷敷面部,外用玉泽精华乳,2次/d,检测患者首诊及治疗2 w(随访到33例患者)、4 w(随访到19例患者)时PBMC SOCS1 mRNA、CKLF1 mRNA 的表达情况。诊断标准:根据2009年中国医师协会皮肤科分会美容专业组提出的《激素依赖性皮炎诊治指南》与第四版《中国临床皮肤病学》及文献[1]制定,纳入标准为热毒炽盛证FCDD患者。排除标准:1个月内系统使用糖皮质激素、抗生素、免疫抑制剂、抗组胺药治疗;合并(真菌、细菌、病毒)感染者;肝肾功能损害或其他系统疾病者;患有过敏性疾病、银屑病等影响试验结果的疾病;妊娠及哺乳期妇女;对方中草药成分过敏者;未能按时随诊,不能按时服药或不能耐受药物不良反应的患者。评分依据近年FCDD相关文献[2-3],采用4级评分法对患者的主观、客观指标进行评分。疗效评价标准:根据尼莫地平法计算公式计算疗效指数,痊愈:皮损几乎完全消退,自觉症状消失,疗效指数>90%;显效:皮损明显消退,自觉症状有明显的减轻,60%<疗效指数≤90%;有效:部分皮损消退,自觉症状有所减轻,20% <疗效指数≤60%;无效:极少部分皮损消退,自觉症状变化不明显甚至加重,疗效指数≤20%。总有效率=(痊愈例数+显效例数+有效例数)/总例数×100%。本次研究经过本院医学伦理委员会同意并与患者签署了知情同意书。

1.2仪器与试剂:RNAisoplus、RT-PCR试剂盒、引物(内参GAPDH、SOCS1、CKLF1,且引物终浓度均为10 μmol/L)(大连宝生物工程有限公司);焦炭酸二乙酯(DEPC)(大连宝生物工程有限公司);实验室超纯水系统ELGAPURELAB Ultra(英国 ELGA Lab Water公司);小型高速冷冻离心机5415D、台式高速大容量离心机5804R、核酸蛋白测定仪(德国eppendorf公司);实C-1000型荧光定量 PCR 仪(美国Bio-Rad公司)。

1.3方法:本试验所有样本均抽取2 ml外周静脉血,EDTA抗凝,-80℃低温冻存。参照试剂盒操作说明提取单个样本总RNA,总RNA浓度和纯度的测定,总RNA完整性的检测,逆转录合成cDNA,SYBR Green I 实时荧光定量 PCR,PCR 产物电泳。基因的相对定量用ΔCT表示(Ct值表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数,ΔCT=目的基因Ct值-内参基因Ct值,mRNA表达量与ΔCt值呈反比关系)。

1.4统计学分析:使用SPSS20.0统计软件进行t及χ2检验。

2 结果

2.1SOCS1、CKLF1 扩增产物的鉴定:在PCR的扩增曲线中每条反应管的扩增曲线拐点清楚,标准的基线平直或略微下降,无明显的上扬趋势,平行性好,表明其扩增效率相近,试验重复性好。

2.2FCDD组与对照组外周血SOCS1、CKLF1的表达:FCDD患者 SOCS1、CKLF1 mRNA的ΔCT 值均小于对照组,二者差异有统计学意义(P均<0.05),ΔCT 值与 mRNA表达量呈反比关系,因此FCDD组外周血中SOCS1、CKLF1 mRNA的表达量明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);患者SOCS1、CKLF1 mRNA的表达经祛风清热凉血方治疗2 w时较治疗前、治疗4 w时较治疗2 w时明显降低,且差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1 FCDD患者与正常对照组及祛风清热凉血方治疗2 w、4 w时SOCS1、CKLF1相对表达量的比较

2.3祛风清热凉血方治疗对SOCS1、CKLF1 mRNA表达的影响:2 w时与治疗前、治疗4 w时与治疗2 w比较,SOCS1、CKLF1 mRNA均显著下降,且差异均有统计学意义(P均<0.05),见表1。

2.4祛风清热凉血方治疗FCDD患者4 w时和2 w时疗效比较:祛风清热凉血方对FCDD有较好的治疗作用,并且远期疗效更佳。见表2。

表2 祛风清热凉血方治疗FCDD患者4 w时和2 w时疗效比较[n(%)]

3 讨论

近年来Th细胞比例失衡在激素依赖性皮炎发生中的作用引起了众多学者关注,而研究人员大多认为FCDD属变态反应类疾病,Th细胞分化失衡可能是FCDD发病基础[4]。SOCS1通过作用于JAK/STAT信号途径在抑制Thl细胞增殖的同时促进Th2细胞分化[5],在Th1/Th2分化失衡所引发的各种变态反应性疾病中起重要作用。研究发现SOCS1表达的增高是调节Th1和Th2相互平衡的重要机制,体外实验证实SOCS1在Th1细胞表达是在Th2细胞的5倍[6],这提示SOCS1可能参与了Th1/Th2分化的调节并且与免疫紊乱导致的疾病有关。有研究显示,IL-6 可以通过活化STAT3上调CD4+T细胞SOCS1的表达,高表达的SOCS1对IFN-γ的分泌抑制,说明SOCS1主要是抑制IFN-γ介导的信号途径,从而对 Th1 细胞分化起到抑制,引起以Th2占优势的Th1/Th2免疫失衡[7]。研究发现SOCS1可以通过抑制IFN-γ而促进Th17细胞的分化[8]。综上SOCS1可能是通过抑制IFN-γ/STAT1信号通路调节Th17细胞增殖,同时对Th1细胞分化起到抑制,引起以Th2占优势的免疫失衡。本研究发现SOCS1在FCDD患者外周血中表达水平增高,表明SOCS1可能参与了FCDD的发病过程,而目前并无对SOCS1在FCDD患者中的报道。

CKLF1是趋化因子家族的一员,对淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞等有广谱趋化活性,并促进炎性反应效应,参与免疫介导的炎性反应性疾病病理过程[9]。研究发现CCR4与其配体CKLF1的结合趋使Th2细胞从血液移至皮肤组织使Th1/Th2细胞亚群失衡[10],而IL-4水平表达升高时SOCS1又可以通过干扰IFN-γ信号诱导的STAT1磷酸化过程,抑制Th1细胞分化[11],从而达到协同作用,与本研究得出的SOCS1与CKLF1 mRNA的表达量呈正相关一致,但差异无统计学意义,可能与样本含量有关。也有学者发现过敏性鼻炎患者鼻黏膜CKLF1与CCR4表达量较正常人明显增高,CKLF1的表达与Th2细胞呈显著正相关,同时CKLF1表达与鼻腔分泌物涂片及下鼻甲黏膜刮片嗜酸性粒细胞计数也呈显著正相关性,说明CKLF1可能在变应性鼻炎嗜酸性粒细胞与Th2细胞的活化及浸润中起到了重要作用,使过敏性鼻炎患者鼻黏膜局部CD4+T淋巴细胞主要向Th2分化,出现以Th2细胞表达升高而导致的Th2与Th1比例失调[12]。本研究显示,推测CKLF1可能通过与Th2细胞表面的CCR4受体结合,使Th2细胞过度趋集活化导致Th1/Th2失调,同时CKLF1可能通过嗜酸性粒细胞表面的CCR4或其他受体,参与其嗜酸性粒细胞活化从而影响FCDD的发病,而目前并无对CKLF1在FCDD患者中的报道。

祛风清热凉血方主要作用于热毒炽盛证的FCDD患者,中医认为激素类药物药性多属辛温、燥热之品,长期外用可导致药物毒邪侵犯肌肤,久之郁而化热,使颜面部血热瘀毒,故面部出现红斑、毛细血管扩张、灼热、瘙痒、皮肤变薄等。本研究结果表明推测祛风清热凉血方可能通过抑制SOCS1,CKLF1的表达,影响Th17、Th2的分化进而调控体内Th1/Th2/Th17细胞亚群功能的平衡状态,在FCDD中起到免疫调节作用。Th17细胞主要分泌的促炎因子IL-17可以促进嗜酸性粒细胞浸润,同时对Th2免疫应答具有正调节作用,祛风清热凉血方可能通过下调SOCS1的高表达提高Th1细胞的表达,减少Th17细胞分泌 IL-17,在一定程度上减弱对Th2细胞的正调控作用,从而纠正Th细胞亚群失衡,另一方面祛风清热凉血方可能抑制了CCR4与其配体CKLF1结合的相互作用而产生抗炎效应,调节Th2细胞的过度趋集活化恢复Th1/Th2平衡,减轻了FCDD的炎性反应,发挥免疫抑制作用。通过对各单味药的现代药理研究,本方的作用可能为抗炎、抑制过敏、调节免疫反应,但中医学强调整体观念研究问题,祛风清热凉血方疗效确切,但其治疗作用并非是通过对各单味药物的药理作用叠加而成,其具体作用机制还未明了,有待进一步研究[13-15]。