长链非编码RNA 在原发性肾小球肾炎的研究进展

赵元梅 ,胡文刚 ,谭小红 ,张娥 ,杜静

陆军军医大学第二附属医院1肾内科,2泌尿外科 重庆市,400037

原发性肾小球肾炎是一组以大量蛋白尿以及高脂血症为主要临床特征的肾脏疾病综合征[1],主要包括微小病变肾病、系膜毛细血管性肾炎、IgA肾病、局灶节段性肾小球硬化症、膜性肾病等病理类型,其中大量蛋白尿为该病的核心特征,肾小球滤过屏障最外层的足细胞损伤在原发性肾小球肾炎蛋白尿的发展中起着关键作用[2]。高脂血症是该病的另一个重要特征,通常出现在疾病的急性期,并在病情缓解期消失,脂蛋白合成增强及代谢降低被认为是导致原发性肾小球肾炎高脂血症的潜在机制[3]。但该病的具体发病机制尚不清楚。长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA) 是一种非编码的调控RNA,在许多细胞机制中发挥核心作用,包括调节细胞过程[4],还可通过基因印迹、组蛋白修饰、染色质重塑和其他机制调节病理生理过程[5]。越来越多的学者报道了lncRNA 与原发性肾小球肾炎之间的关系,其异常表达在原发性肾小球肾炎发生发展过程中起着至关重要的作用,但目前此领域的综述文献较为匮乏。本研究就lncRNA 在原发性肾小球肾炎发生发展过程中的作用进行综述,总结如下。

1 lncRNA

1.1 lncRNA 概述

lncRNA 为一类长度超过200 个核苷酸且无蛋白质翻译能力的线性RNA,存在于真核生物中[6],主要由RNA 聚合酶Ⅱ转录,并可通过5′帽子、3′多腺苷酸化和剪接进行修饰[7]。因不具备蛋白质编码功能,lncRNA 曾被视为转录“噪声”,无法发挥生物学功能。迄今为止,仅有极少数的lncRNA 功能被验证。随着转录组学的进步以及人们对lncRNA 的不断深入探究,lncRNA 已被证明参与许多人类疾病,如肿瘤[8-9]、神经退行性疾病[10]、肾脏相关疾病[11-12]等。因此,lncRNA 构成了一类重要的新型生物标记物,与细胞生理学、器官稳定和病理过程密切相关。

1.2 lncRNA 分类

目前尚无针对lncRNA 的统一分类标准,根据长度、位置、功能以及靶向机制,可将其进行分类。按照在基因组中lncRNA 与蛋白质编码基因的相对位置关系,分为正义、反义、双向、内含子、基因间和增强子lncRNA,其功能取决于所在的位置。同时,lncRNA 通常根据其功能机制分为诱饵、支架、信号和导向lncRNA。近年来,多项研究报道认为,lncRNA 能够编码功能性小肽(也称为微肽),并以特异性的方式对一般生物过程进行调节[13-14],这更深层次地揭示了lncRNA 的临床价值和复杂性。

1.3 lncRNA 的功能及作用机制

lncRNA 调节基因表达的机制尤其复杂,尚未完全阐明,通常认为具体包括如下几种: ①通过靶向miRNAs、mRNAs 或者蛋白质,并对其活性与稳定性进行调节,继而在转录后发挥作用;②通过直接结合DNA 或者转录因子,从而在转录水平上实现调控基因表达的作用;③通过组蛋白修饰、染色质结构重塑或DNA 甲基化以表观遗传学方式对靶基因发挥抑制作用[15]。

阐明lncRNA 作用的分子机制是一项具有挑战性的任务,可以通过应用多种检测方法来完成。应用定量PCR (quantitative PCR,qPCR)、RNA 荧光原位杂交 (RNA-fluorescent in situ hybridization,RNA-FISH)、RNA-FISH 与随机光学重建显微镜法(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM) 相结合以及使用与荧光标签相连的适配体标记lncRNA 等方法能够确定lncRNA 在细胞内的定位。利用小干扰 RNAs (small interfering RNAs,siRNAs)、短发夹 RNAs (short hairpin RNAs,shRNAs)、反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASO) 或使用CRISPR/Cas9 技术进行基因敲除/基因敲入,在RNA 沉默介导下敲除lncRNA,从而实现更深入的功能表征。发现lncRNA功能的另一个重要里程碑是二级和三级lncRNA 结构的建立。化学或酶探针、鸟枪二级结构片段分析或计算预测是揭示二级结构最常用的方法。而三级结构和三级lncRNA 相互作用的确定一般采用溶液态核磁共振 (nuclear magnetic resonance,NMR)光谱、小角度散射(small-angle scattering,SAS)、X 射线衍射或冷冻电子显微镜来实现。最后,计算建模可用于深入了解二级和三级RNA 结构预测。由于lncRNA 并非单独起作用,而是与蛋白质或多分子复合物联合起作用,因此确定lncRNA 与蛋白质相互作用 (lncRNA-protein interactions,LPIs)对理解其分子功能至关重要。根据针对的是lncRNA 蛋白复合物中的蛋白质还是RNA 成分,可以区分以蛋白质为中心和以RNA 为中心的LPI 测定法。

2 lncRNA 在原发性肾小球肾炎的研究进展

lncRNA 在原发性肾小球肾炎的研究并不深入,相关疾病报道比较少见,大多数lncRNA 的功能及作用机制并不完全明确。越来越多的证据表明,lncRNA 在多种细胞功能中发挥作用。近年来,随着人类全基因组测序技术的日益发展,关于lncRNA 与原发性肾小球肾炎之间的关系也逐渐得到论证。

2.1 lncRNA 与IgA 肾病

IgA 肾病属于一种由IgA 形成的复合物沉积于肾小球系膜区的疾病,可导致肾小球炎症和进一步的肾损伤[16]。在IgA 肾病中,lncRNA 不仅参与细胞因子和炎症的调节,还与B 细胞和巨噬细胞有关。Bi 等[17]研究表明,lncRNA 垂体瘤转化因子3假基因(pituitary tumour-transforming 3 pseudogene,PTTG3P) 诱导糖基化IgA 的异常产生,此外,与健康受试者相比,lncRNA PTTG3P 在IgA 肾病患者肾组织样本中过表达,且IgA 肾病患者尿PTTG3P水平也高于健康对照组,同时,PTTG3P 过表达可刺激B 细胞生长并增强细胞周期蛋白D1 和Ki-67的表达,并诱导白介素-1β (interleukin-1β,IL-1β) 和IL-8 的产生。既往研究[18]也认为,IL-1β和IL-8 在IgA 肾病的发生和发展中起着关键作用。因此,PTTG3P 在IgA 肾病的进展中发挥着关键作用。Shen 等[19]研究提出,通过检测lncRNA 结直肠癌差异表达基因(colorectal neoplasia differentially expressed,CRNDE)、含pyrin 结构域NOD 样受体家族3 (NOD-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3) 炎症小体相关蛋白在外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs) 和J774 A.1 细胞中的表达水平,并检测IgA肾病患者血清和体外IgA 肾病模型细胞上清液中的炎症细胞因子水平,结果显示,与对照组相比,CRNDE 和NLRP3 炎症小体相关蛋白在PBMCs 和J774 A.1 细胞中的表达以及在IgA 肾病患者血清和IgA-IC 诱导的J774 A.1 细胞中的表达均显著上调,CRNDE 沉默下调了NLRP3 炎症小体相关蛋白和细胞上清液中IL-1β、肿瘤坏死因子-α (tumour necrosis factor-α,TNF-α) 和白介素-12 (interleukin-12,IL-12) 的水平,而NLRP3 过表达则逆转了这些作用,此外,CRNDE能够与NLRP3 相互作用并促进NLRP3 表达,抑制CRNDE则可降低NLRP3蛋白水平,并促进TRIM 家族成员31 (TRIM family member 31,TRIM31) 介导的NLRP3 泛素化和降解,故lncRNACRNDE可通过促进巨噬细胞中NLRP3 炎症小体的激活而加剧IgA 肾病的进展。一些lncRNA 可以用作疾病的生物标志物。IgA 肾病患者中lncRNA MYEF2-1.1 表达较健康对照组低85倍,而ALOX15 P1-ncNR045985 表达较健康对照组高5.15 倍[20]。Sun 等[21]报道则指出,IgA 肾病儿童中,lncRNA 中含有5 个PH 结构域的反义RNA1(PH domain containing 5 antisense RNA1,FGD5-AS1) 和PTEN 下调表达,miR-196b-5p 上调表达,同时,体外实验证实,FGD5-AS1 可通过miR-196b-5p 靶向磷酸酶与张力蛋白同源物(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN) 介导的JNK/c-Jun 信号转导来抑制IgA 肾病,FGD5-AS1 可能是IgA 肾病的一个新的治疗靶点。He 等[22]通过对204 例IgA 肾病患者进行分析发现,与健康对照组相比,IgA 肾病患者lncRNAH19 表达显著下调,通过调整其他潜在的临床、病理和治疗因素后,发现H19 是IgA 肾病预后的保护因素 (HR=0.52,95 %CI: 0.32～0.84,P=0.008),与H19≤0.097 患者相比,H19 ＞0.097 的IgA 肾病患者5 年内肾脏进展风险降低约70 %(HR=0.30,95 %CI: 0.12～0.74,P=0.009),故高水平的lncRNAH19 通常提示IgA 肾病患者5年内肾功能改善。Guo 等[23]研究显示,lncRNAG21551 在IgA 肾病患者中显著下调,有趣的是,与lncRNA-G21551 最接近的蛋白质编码基因被发现能够编码免疫球蛋白G 的Fc 片段低亲和力受体。Wen 等[24]则观察到IgA 肾病肾组织中细胞间黏附分子-1 (intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1) 相 关 lncRNA (related long noncoding RNA,ICR) 水平显著升高,且ICR 参与了肾脏纤维化过程,其作用机制为抑制蛋白激酶B (protein kinase B,PKB/Akt)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR) 信号通路并减少Akt 和mTOR 磷酸化,从而减弱转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1) 诱导的肾近端小管细胞纤维化改变。故lncRNA 有望作为一种潜在的新型非侵入性IgA 肾病生物标记物。最近,在IgA 肾病患者和健康个体的单核细胞中进行的微阵列分析发现了250 多种差异表达的lncRNA和mRNA,主要参与先天免疫反应的调节[25]。在应用系统生物学方法的其他研究中也发现了类似的结果,PBMC 中差异表达的约217 个lncRNA 已被认为是参与IgA 肾病病理生理学的潜在因素,其中HOX 转录反义 RNA (HOX transcript antisense RNA,HOTAIR) 是IgA 肾病中调节差异表达基因/miRNA 最重要的lncRNA[26]。通过进一步探索lncRNA 在IgA 肾病中的功能和调节机制,有助于确定潜在的筛选生物标志物和新的治疗靶点。

2.2 lncRNA 与膜性肾病

膜性肾病是一种肾脏特异性自身免疫性疾病,是成人肾病综合征最主要的病因。Huang 等[27]通过使用实验性膜性肾病小鼠模型鉴定了第一个失调的lncRNA,X 染色体失活特异性转录物(X chromosome inactivation,XIST) 和核斑点旁组装转录1 (nuclear paraspeckle assembly transcript 1,NEAT1),肾小球细胞以及肾小管上皮细胞中XIST、NEAT1 水平明显升高,而XIST 启动子区组蛋白H3 第27 位氨基酸三甲基化 (Tri-methylation of lysine 27 on histone H3,H3K27me3) 水平在小鼠膜性肾病肾脏中显著下调,同时还发现,包括膜性肾病在内的肾小球肾炎患者尿液XIST 显著升高。lncRNA 可通过调节细胞凋亡影响膜性肾病进程。Jin 等[28]研究显示,膜性肾病患者的肾组织中lncRNA XIST 和血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ) 明显上调表达,AngⅡ可诱导足细胞XIST 增加和细胞凋亡,XIST 下调可逆转AngⅡ诱导的足细胞凋亡,并通过负调控miR-217 来上调Toll 样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4) 表达,TLR4 表达上调可促进足细胞凋亡和膜性肾病进程,反之,XIST 下调可通过miR-217/TLR4 途径改善足细胞凋亡,这可能会有利于改善膜性肾病。NEAT1 在白蛋白刺激的肾小管上皮细胞和膜性肾病肾小管组织中呈时间依赖性上调,在白蛋白刺激的近端肾小管上皮细胞中,NEAT1过表达可增加细胞凋亡并减少细胞增殖,并通过抑制Noxa (一种Bcl-2 同源物3-唯一的蛋白质) 介导的抗凋亡蛋白活性,进而诱导细胞凋亡并促进膜性肾病的进展[29]。lncRNA 参与了lncRNA-miRNA-mRNA 共表达网络以及ceRNA 网络的构建。通过构建一个由4 个mRNA(EPB41L5、FAM43A、PRKG1、TTC14)、3 个lncRNA(LINC00052、LINC00641、N4BP2L2-IT2)和5 个miRNA (hsa-miR-145-5p、hsa-miR-3605-5p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-497-5p、hsa-miR-148b-3p)组成的ceRNA 网络发现,LINC00052-hsa-miR-145-5p-EPB41L5、LINC00052-hsa-miR-148a-3p-FAM43A、LINC00641-hsa-497-5p-PRKG1 下调可能与膜性肾病的发展有关[30]。另外,通过lncRNA-miRNA-mRNA 网络构建,探索ceRNA 的相互作用,在KCNQ1OT1-miR-204-5p-SRY盒转录因子4 (SRY-box transcription factor 4,SOX4)途径中,mRNA SOX4 可通过与海绵状KCNQ1 OT1-miR-204-5p 相互作用促进膜性肾病的进展[31]。lncRNA 引起的表观遗传失调所致的基因表达变化越来越被认为是促进膜性肾病发生发展的重要因素。

2.3 lncRNA 与系膜毛细血管性肾炎

系膜毛细血管性肾炎的病理特征为系膜扩张以及在系膜中能够发现免疫球蛋白沉积,但其病因机制仍不清楚。Yu 等[32]报道表明,lncRNA uc.412过表达可明显促进系膜细胞增殖,且通过RNA 测序评估过表达uc.412 的系膜细胞转录谱,共鉴定出462 个上调基因以及843 个下调基因,且这些差异表达基因参与了多条与系膜细胞增殖相关的信号通路,这可能有助于为探究治疗系膜增生性肾脏疾病的新方法提供指导。通过微阵列表达分析测试表明数千个lncRNA 和蛋白质编码基因在IgA 阴性系膜毛细血管性肾炎中显著差异表达,一些lncRNA与其相邻的蛋白质编码基因密切相关并协同表达,lncRNA 网络调控失衡可能是IgA 阴性系膜毛细血管性肾炎发展的一种潜在机制[33]。

2.4 lncRNA 与局灶节段性肾小球硬化症

局灶节段性肾小球硬化症由肾小球中足细胞功能障碍和凋亡引起。lncRNA 对该病的作用知之甚少。与其相关的lncRNA 之一是lncRNA LOC105375913,lncRNA LOC105375913 表达增加可降低miR-27b 水平,促进snail 过表达,并导致肾小管间质纤维化[34]。局灶节段性肾小球硬化症患者的足细胞中lncRNA LOC105374325 上调表达,其机制与P38/CCAAT增强子结合蛋白β (CCAAT enhancer-binding protein β,C/EBPβ) 通路的激活有关,进而可增加Bcl-2 相关X、促凋亡蛋白 (BCL2-associated X,apoptosis regulator,Bax) 和BCL-2 拮抗/杀伤因子1 (BCL2 antagonist/killer 1,Bak) 表达,并降低患者足细胞中miR-34c 和miR-196a/b 水平,从而导致足细胞凋亡[35]。

3 小结及展望

越来越多的lncRNA 已经显示出编码蛋白质的能力,这可能与其在疾病中的作用机制有关。由于lncRNA 在不同物种、生命阶段、组织和器官中的差异和特异性表达,推测lncRNA 作为生物标记物具有更好的潜力,并可能在不同细胞、组织和生命周期中发挥作用。随着基因组学的发展,已经发现了大量与人类疾病有关的lncRNA,包括肾脏疾病。lncRNA 作为原发性肾小球肾炎发病机制、诊断生物学标记物以及治疗靶点探究的新领域,能够为原发性肾小球肾炎的诊断和治疗提供科学根据。尽管目前已初步了解了lncRNA 在原发性肾小球肾炎中的调控机制,但其介导的基因表达调控网络及作用机制尚需开展深入研究。随着人类全基因组测序技术的飞速进步,有望发现更多与原发性肾小球肾炎有关的lncRNA,并开展更多有意义且更深层次的研究。