基于网络药理学研究甘草泻心汤治疗复发性口腔溃疡的作用机制

袁园，秦雷明，庆慧，崔伟锋*

复发性口腔溃疡（recurrent oral ulcer，ROU）是发病率很高的一种口腔黏膜类疾病，其发病率接近20%［1］，具有周期性、复发性以及自限性等特点。ROU 发病人群的年龄一般在10～30 岁之间，且患病的女性较多。ROU 的发病机制目前尚不清楚，其发生可能与遗传、免疫、饮食、微生物、微量元素缺乏、维生素缺乏、精神心理等多种因素有关［2］，目前尚无特效治疗方法［3］。现阶段，西医的治疗以补充维生素、服用抗菌药物等手段为主，但是长期服用易损伤肝肾功能并产生耐药性，而且容易复发，部分患者的治疗效果不理想［4-5］。中医学将ROU归为“口疮”“口疡”“口糜”等范畴，《金匮要略》［6］称之为“狐惑病”，记载为“狐惑之为病，状如伤寒，默默欲眠，目不得闭，卧起不安，蚀于喉为惑，蚀于阴为狐，不欲饮食，恶闻食臭，其面目乍赤、乍黑、乍白。蚀于上部则声喝，甘草泻心汤主之”。中医学认为该症多因胃热脾寒引发口疮，且外有热象内有虚寒，为寒热错杂之证［7］。临床上应用甘草泻心汤治疗ROU 已积累了丰富的临床经验且疗效良好，但其作用机制尚不明确。基于网络药理学的方法可构建“疾病-药物-成分-靶点”网络，并从整体观察及分析中药组方对疾病的影响。中医在临证组方配伍时遵循方证一体观，突出方剂的整体性能，网络药理学的研究方法与中医的整体观相符。本研究将运用网络药理学的研究方法和分子对接技术对甘草泻心汤治疗ROU 的作用机制进行探究，为临床和进一步研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 甘草泻心汤的主要成分及靶点的获取

在中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）数据库［8］中，将关键词设置为“Herb name”并检索 7 味中药（半夏、黄连、黄芩、干姜、甘草、人参、大枣）的化学成分，根据口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30% 以及药物相似度（drug-likeness，DL）≥0.18 对成分进行筛选，以获得有效活性成分及其作用的蛋白质靶点。

1.2 靶点名称的标准化处理

在Uniprot 蛋白质数据库［9］中输入搜索到的蛋白质靶点，将Status 设为“Reviewed”，Popular organisms 设为“Human”，把检索到的靶点名称转化为Official Gene Symbol，以便后续的数据分析。

1.3 “中药-活性成分-相关靶点”网络构建

将检索出的药物成分和蛋白质靶点合并整理后，导入Cytoscape 3.8.0 软件绘制“中药-活性成分-相关靶点”网络图。将度值（degree）从大到小排列，排名前4 位的有效活性成分作为关键活性成分。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建

在GeneCards 数据库［10］中以“recurrent oral ulcer”为关键词进行检索，得到疾病靶点485 个，与药物成分靶点合并后去掉重复靶点，得到交集靶点43 个。利用STRING 数据库［11］对交集靶点进行分析（将研究物种设定为“Homo sapiens”），得到蛋白质相互作用关系，然后将数据导入Cytoscape 3.7.1 软件绘制PPI 网络。利用Cytoscape 中的插件Network Analyzer 对所得到的网络进行拓扑学分析，根据所得数据中的度值、紧密中心性、介数中心性3 个参数筛选出核心靶点。

1.5 基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因和基因组数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

将交集靶点导入微生信平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）进行KEGG 通路富集分析及GO 注释，得到富集结果、GO 功能气泡图、KEGG 通路气泡图以及相关信号通路图。

1.6 分子对接

选定的关键活性成分和核心靶点的分子对接模拟计算通过Autodock 1.5.6 软件来完成。从PDB（Protein Data Bank）数据库（https：//www.rcsb.org/）中下载文件格式为PDB 的核心靶点结构文件，再从TCMSP 数据库中下载文件格式为MOL2 的关键活性成分结构文件。在AutoDock 1.5.6 软件中将蛋白质靶点的PDB 文件去水加氢设为受体，将活性成分的MOL2 文件加全氢后设置为配体；设置对接Box 后运行Autogrid4、设置对接参数及运算方法后运行Autodock4，得到分子对接结果。

2 结果

2.1 甘草泻心汤活性成分和靶点筛选

利用TCMSP 数据库对中药成分进行初步筛选后，可分别得到甘草泻心汤中7 味中药的有效活性成分（半夏13 种、黄连14 种、黄芩36 种、干姜5种、甘草92 种、人参22 种、大枣29 种），以及有效活性成分对应的相关靶点（半夏93 个、黄连176 个、黄芩113 个、干姜41 个、甘草215 个、人参107 个、大枣194 个）。将7 味中药中无对应蛋白质靶点的有效活性成分剔除后合并，再删除重复成分后得到甘草泻心汤的有效活性成分共164 种，涉及268 个有效成分靶点。筛选出度值排名前20 位的成分见表1。

表1 甘草泻心汤的部分有效活性成分（度值排名前20 位）

2.2 “中药-活性成分-相关靶点”网络构建

利用 Cytoscape 3.8.0 软件绘制“中药-活性成分-相关靶点”网络图（图1），网络由439 个节点构成，包括3450 条边。经Analyze Network 分析，甘草的度值最高，为88；度值排名前4 位的关键活性成分为C2（槲皮素）、A1（β-谷甾醇）、B1（豆甾醇）、D1（山柰酚），其度值依次为429、181、124、117。

GC：甘草；HQ：黄芩；DZ：大枣；RS：人参；BX：半夏；HL：黄连；GJ：干姜。紫色：中药；黄色：活性成分；粉色：关键活性成分；蓝色：相关靶点；图形大小与度值相关，度值越大，图形越大图1 甘草泻心汤治疗ROU 的“中药-活性成分-相关靶点”网络图

2.3 PPI 网络构建

将有效活性成分相关靶点和疾病相关靶点合并去重后共得到43 个交集靶点，导入STRING 数据库中，进行蛋白质相互作用分析，通过Cytoscape3.7.1 软件对结果进行可视化，构建PPI 网络（图2），该网络图包括43 个节点，606 条边。根据拓扑学分析得到的参数进行筛选，共得到10 个核心靶点，分 别 为IL-6、TNF、IL-1β、ALB、CCL2、IL-10、VEGFA、MMP9、VCAM1、ICAM1。 核 心靶点的拓扑学参数见表2。

图2 甘草泻心汤治疗ROU 的PPI 网络图

表2 甘草泻心汤治疗ROU 的核心靶点的拓扑学参数

2.4 GO 功能和KEGG 通路富集分析

将有效活性成分和疾病相关靶点取交集后得到的43 个交集靶点，导入微生信平台进行GO 功能和KEGG 通路富集分析。共得到3078 个GO 富集条目，其中包括生物过程（biological process，BP）2740 个，主要涉及对脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide）、对细菌来源分子的反应（response to molecule of bacterial origin） 等；细胞组成（cellular component，CC）124 个，涉及膜筏（membrane raft）、膜微区（membrane microdomain）、膜区（membrane region）等；分子功能（molecular function，MF） 214 个，涉及细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、细胞因子活性（cytokine activity）、受体配体活性（receptor ligand activity） 等。 以P≤0.01 为条件进行筛选并按照P值由小到大进行排列，选取排名前10 的条目进行可视化处理（图3～5）。KEGG信号通路富集共获得174 条通路，以P≤0.01 为条件进行筛选并按照P值由小到大进行排列，选取排名前10 的条目进行可视化处理（图6）。通路主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、细胞流体剪切应力与动脉粥样硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、TNF信号通路（TNF signaling pathway）、IL-17 信号通路（IL-17 signaling pathway）等信号通路。

图3 甘草泻心汤治疗ROU 的GO 富集分析结果（生物过程）

图4 甘草泻心汤治疗ROU 的GO 富集分析结果（细胞成分）

图5 甘草泻心汤治疗ROU 的GO 富集分析结果（分子功能）

图6 甘草泻心汤治疗ROU 的KEGG 富集分析结果

2.5 分子对接

筛选得到的关键活性成分为槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇；PPI 网络度值前4 的核心靶点是IL-6、TNF、IL-1β、ALB。 利用AutoDock 1.5.6 软件对筛选出的关键活性成分和核心靶点进行分子对接模拟计算，关键活性成分与核心靶点对接结果见表3。该结果表明，甘草泻心汤中关键活性成分与核心靶点的结合能均≤-5.0kJ/mol，提示关键活性成分与核心靶点均具有良好的结合活性。采用PyMol 软件对分子对接结果进行可视化，部分关键活性成分与核心靶点的分子对接结果见图7。

表3 关键活性成分与核心靶点对接结果 kJ/mol

A：IL-6 与山柰酚；B：ALB 与豆甾醇；C：IL-1β与豆甾醇；D：TNF 与β-谷甾醇图7 部分关键活性成分与核心靶点的分子对接示意图

3 讨论

ROU 发病的原因很复杂［2，12］。口腔黏膜因各种原因受到损伤后，由细胞免疫介导的免疫细胞和细胞因子级联反应可进一步导致损伤部位的黏膜损伤、炎症细胞的聚集、坏死组织的吞噬以及受损黏膜中不同大小溃疡的形成。患者发病时常伴有肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF） 、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-8、IL-10 等 炎 症 因子的异常表达，产生的炎症反应贯穿ROU 整个病理生理进程［13］，并进一步加重黏膜损伤，影响溃疡病灶愈合，使病情恶化。ROU 的发病率较高，在免疫功能紊乱的人群中，其发病率会进一步升高。

中医学对ROU 的病因认识较为清楚，临床以寒热错杂型的病症最为多见，这也是该病反复发作的原因之一［14］。甘草泻心汤由7 味中药组成，方中黄芩、黄连苦降以除热；干姜、半夏辛温开结以散寒；人参、甘草、大枣益气补虚兼生津液，防苦寒伤阳，又防辛热伤阴。诸药合用，则辛开苦降，寒热平调，标本兼治［15］。临床研究发现，ROU 患者溃疡发作期CD3+T 淋巴细胞和 CD4+T 淋巴细胞明显减少，患者细胞免疫水平明显低于正常范围［16］；而经甘草泻心汤治疗后的患者，CD3+、CD4+、CD4+/ CD8+升高，CD8+显著降低，提示甘草泻心汤可以有效提高ROU 患者免疫功能［17-18］。

本研究借助网络药理学的研究方法，对甘草泻心汤治疗ROU 的潜在作用机制进行深入分析。根据“中药-活性成分-相关靶点”网络分析得到了4 个关键活性成分，分别是β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素、山柰酚。其中，槲皮素能够极显著地抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导RAW264.7 细胞分泌炎症介质NO 以及促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6，提示槲皮素有理想的体外抗炎效果［19］；山柰酚能够显著抑制LPS 诱导的人单核细胞THP-1 中巨噬细胞产生的趋化因子（macrophage-derived chemokine， MDC），干扰素γ诱导蛋白10（interferonγinducible protein-10，IP-10）以及IL-8 等炎症因子的产生，从而有效抑制炎症进展［20］；Pandith 等［21］研究发现，飞机草（Chromolaena odorata）提取物中的豆甾醇能明显减少由脂多糖LPS 诱导增多的致炎因子环氧合酶-2（cyclooxygenase 2，COX-2）和诱生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS） 的表达，同时抑制前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）和NO 的释放，从而发挥其抗炎作用。在ROU 的发生过程中，T 细胞介导的细胞因子水平有所变化，如IL-1、IL-2、IL-6 等促炎因子分泌会增加，而抗炎因子IL-10 分泌会减少。应用β-谷甾醇治疗时，大多数促炎细胞因子和单核细胞趋化蛋 白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）的表达水平都有所下降，而抗炎因子IL-10 的表达上调［22］。

对PPI 网络图进行分析，IL-6、IL-1β、ALB、TNF、CCL2、VEGFA、NOS3 等为核心靶点。其中，IL-1β为致炎因子之一，能刺激IL-2、IL-6、IL-8 等其他细胞因子的产生并相互影响。IL-6 是促进B 淋巴细胞、T 淋巴细胞活化，参与免疫应答以及炎症反应的关键成分［23］。ROU 患者TNF-α水平升高可刺激IL-2、IL-6 等细胞因子功能及数量的改变，从而破坏细胞因子网络平衡，并引起IL-2、IL-6 等促炎因子的释放及抑制IL-10 释放，从而加重炎症反应，使溃疡加重［24］。CCL2 能够诱导小胶质细胞产生TNF-α，进而促进T 淋巴细胞产生炎症因子，促进炎症进程［25］。

对甘草泻心汤治疗ROU 的关键靶点进行GO功能分析，包括BP、MF 和CC［26］。甘草泻心汤治疗ROU 涉及BP 主要为对LPS 的反应、对细菌来源分子的反应、细胞间黏附的调节、活性氧代谢过程、白细胞黏附的调节、细胞间黏附的正向调节、白细胞-细胞黏附、白细胞-细胞黏附的正向调节、T 细胞活化、细胞对生物刺激的反应等，其中富集最多的是对LPS 的反应。就MF 而言，主要涉及细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性、信号受体激活剂活性、生长因子受体结合、肿瘤坏死因子受体结合、肿瘤坏死因子超家族受体结合、趋化因子受体结合、生长因子结合、NADP 结合等过程。在CC 方面，目标主要富集在膜筏、膜微区、膜区、细胞质泡腔、囊泡腔、过氧化物酶体、微体、质膜外侧、分泌颗粒腔、血小板α 颗粒腔等。这些结果表明甘草泻心汤可通过调节多种复杂的生物过程来治疗ROU。

KEGG 通路分析结果表明，甘草泻心汤可能通过调控糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、脂质与动脉粥样硬化、疟疾、炎症性肠病、甲型流感、美洲锥虫病、非洲锥虫病、TNF 信号通路、IL-17 信号通路等信号通路，从而治疗ROU。研究表明，当机体处于炎症、创伤、糖尿病等状态时，晚期糖基化终产物（advanced glycation endproducts，AGEs）升高，上调晚期糖基化终产物受体（receptor of advanced glycation endproducts，RAGE）的表达［27］。AGEs/RAGE/NF-κB 信号通路被激活，NF-κB 活化并核移，导致血清IL-1β、TNF-α等炎症介质水平升高，引起组织损伤［28］。基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP9）等基因在振荡剪切应力下表达明显升高，表现为促进抗As基因、抗凝血基因的活化，从而发挥抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗凝效应［29］。IL-17 与炎症的发生和发展有密切的关系，其通过刺激靶细胞释放前炎症细胞因子以及动员中性粒细胞的细胞因子来发挥作用，在诱导IL-6、NO、PGE2 产生的同时上调IL-1β、TNF-α等炎症因子水平，使局部炎症扩大［30］。

此外，分子对接结果显示，关键活性成分和核心靶点对接的结合能均低于-5.0kJ/mol，表明核心靶点与甘草泻心汤关键活性成分之间具有很强的结合能力。

综上所述，甘草泻心汤中的多种活性成分可协同发挥抗炎作用，减少由LPS 诱导增多的炎性因子和趋化因子的产生，并通过作用于TNF、IL-1β、IL-6、CCL2、NOS3 等关键靶点以及参与AGERAGE、NF-κB、IL-17 等信号通路发挥抗炎作用、改善免疫功能。本研究采用网络药理学和分子对接方法，对甘草泻心汤治疗ROU 的成分和靶点进行了分析，阐述了其主要的生物过程和信号通路，为临床和进一步研究甘草泻心汤通过多成分、多靶点、多途径治疗ROU 提供了科学依据。