生鲜乳及乳制品中乳铁蛋白检测方法的研究

苏 霞,刘松雁,朱子晨,赵兴鑫,王 昊,杨晓霞,苗新发

（1.石家庄市畜产品和兽药饲料质量检测中心 050041；2.石家庄市鹿泉区农产品综合质检站 050000；3.行唐县动物卫生监督所 050000；4.行唐县龙州镇农业综合服务中心 050000）

乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）是一种铁结合糖蛋白，主要由中性粒细胞分泌，并广泛存在于哺乳动物的外分泌液中，如乳汁、唾液、泪液、精液和鼻液等。乳铁蛋白分子质量约为80 kDa，具有两个铁离子结合位点，因此具有很高的亲铁性。该蛋白质在人和其他哺乳动物体内具有多种生物学功能，主要包括：抗菌作用、抗炎作用、调节免疫系统、促进铁的吸收和运输、抗氧化作用以及抗肿瘤[1]。

乳铁蛋白在多种生物流体中的浓度变化与多种疾病的发展有着密切关系。例如，在感染、炎症和肿瘤等疾病过程中，乳铁蛋白水平的变化可以作为早期诊断和疗效观察的生物标志物。同时，乳铁蛋白也是营养学研究和食品工业中的重要组分，其含量直接影响到乳制品的品质和营养价值[2]。因此，准确、快速地检测乳铁蛋白对于临床诊断、疾病预防、营养评估和食品安全控制具有重要意义。

1 乳铁蛋白概述

乳铁蛋白可以与细菌的铁离子结合，限制其获得铁的能力，从而抑制细菌生长。此外，乳铁蛋白还能直接与细菌、病毒、真菌和寄生虫的表面相互作用，干扰其生命周期。乳铁蛋白能够减轻炎症，它可以通过抑制细菌生长来减少炎症反应，同时能减轻因病毒引发的炎症反应。乳铁蛋白能够影响T 和B 淋巴细胞的增殖和成熟，影响细胞因子的产生和释放，并通过免疫细胞调节、免疫球蛋白的运输和组织再生等机制调节机体的免疫系统。乳铁蛋白能够将铁离子运输到细胞内，并将铁释放给需要的蛋白质如血红蛋白等，从而在细胞水平上调节铁离子的平衡。乳铁蛋白具备捕捉自由基和减少氧化应激的功能，有利于保护体内细胞结构不受损害。部分研究表明，乳铁蛋白能够抑制肿瘤细胞的生长和转移，其抗肿瘤机制可能与其调节免疫反应、影响肿瘤生长因子等有关。

2 常见乳铁蛋白检测方法

在乳铁蛋白检测过程中，由于乳制品和其他生物样品中的蛋白质和其他组分的复杂性可能会干扰乳铁蛋白的检测；不同样品中乳铁蛋白的浓度差异很大，需要检测方法有较宽的量程和高的灵敏度；食品中的脂质、糖类等杂质也可能对检测方法造成干扰。这些挑战需要通过优化和开发新的检测方法来解决，包括传统的酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫荧光技术、质谱分析以及新兴的生物传感器技术等。每种技术都有其特点和局限性，因此，在实际应用中需要根据检测的目的、样品性质以及可用资源来选择最适合的方法。

2.1 免疫分析法

2.1.1 胶体金法

这种方法利用胶体金作为标记物，通过毛细作用将样品沿纸条移动并与预先固定的抗体发生反应，常常用于快速检测。但这种方法的灵敏度和定量精度可能低于ELISA。井金苗等[3]建立一种能快速定量检测乳制品中牛乳铁蛋白含量的胶体金免疫层析方法，该方法重复性和线性良好且特异性强，为检测样品中的乳铁蛋白提供了一种快速、灵敏、简便的定量检测方法。

2.1.2 酶联免疫分析法

利用抗体的特异性结合原理，通过抗原-抗体的免疫反应，并通过酶标记的检测来定量分析乳铁蛋白。通过涂层对应乳铁蛋白的抗体，然后添加生鲜乳样本，在洗涤后添加二次抗体和底物，通过颜色变化的强度来定量乳铁蛋白含量。在乳铁蛋白检测中，这种方法具有高度的敏感性和特异性。薛辉等[4]建立乳铁蛋白酶免疫分析法，检测乳铁蛋白在血清及乳汁中的水平，该方法稳定、简便、特异适于检测人血清和乳汁中的乳铁蛋白水平。

2.1.3 免疫扩散法

龚广予等[5]介绍了一种检测乳铁蛋白的方法-放射免疫扩散法，乳铁蛋白与抗血清具有特异的免疫反应，经过一系列染色、脱色和清洗后可以测量到反应沉淀带，该沉淀带的直径与参与反应的抗原、抗体浓度成正比，利用该特性可检测乳铁蛋白的含量。这种方法简便、成本低，但相比ELISA 和胶体金法，其灵敏度和分辨能力较低。

2.2 液相色谱法

液相色谱法（HPLC）能够在复杂的样品中分离个别分子，对于乳铁蛋白等蛋白质具有高分辨率。提供准确的定量分析，可以使用外标曲线法等进行定量。需要对样品进行适当的预处理，如蛋白质沉淀、脱脂等，以减少色谱柱的污染。相比凝胶电泳，HPLC 通常具有更快的分析速度，尤其是在高效液相色谱系统中。需要专业的设备和操作技术，操作人员需具备一定的专业知识。苏昭仑等[6]对使用肝素亲和柱-高效液相色谱法快速测定乳粉中乳铁蛋白进行了优化，结果：乳铁蛋白在上述色谱条件下能完全分离。乳铁蛋白线性范围为5.54～110.9 μg/mL，相关系数r=0.999966，方法检出限为12 mg/100 g，定量限为28.5 mg/100 g；平均回收率97.5%～101.9%，相对标准偏差（RSD）＜3.0%。该方法操作简便，精密度和回收率高，重复性好。

2.3 毛细管电泳法

毛细管电泳法（Capillary Electrophoresis, CE）具有极高的分离效率，可以在短时间内分离复杂样品中的多个组分。由于毛细管的体积较小，因此样品消耗量很少，适用于样品量有限的情况下。通过调整电泳条件（如缓冲液pH、电压等），可以分离不同的分子。毛细管电泳装置一般具备自动化操作，分析速度较快。可以进行定量分析，但可能需要较为复杂的标准化和校准过程。路梦凡等[7]使用高通量毛细管凝胶电泳检测不同来源乳中乳铁蛋白含量，，对人源、羊源乳铁蛋白的检出限分别为11.74 μg/mL、3.53 μg /mL，同时也可作为其他特色生鲜乳(牠牛乳、骆驼乳、驴乳等)中乳铁蛋白含量的一种通用性检测方法。

2.4 凝胶电泳法

对蛋白质等大分子生物分子具有良好分辨率。操作相对直接简单，易于掌握，是实验室常规的分析方法之一。通过染色等手段，可直接在凝胶上观察分析结果。与HPLC 和CE 相比，设备和试剂成本较低，适合普通实验室条件。需要对样品进行适当的预处理，如使用SDS-PAGE 进行蛋白质的分离分析时，需加入SDS 对蛋白质进行变性。李珊珊等[8]采用凝胶成像系统SDSPAGE 法测定乳及乳制品中乳铁蛋白，建立了包括分离胶浓度、浓缩胶电压、分离胶电压、染色、点样量等操作条件，结果准确度高，重复性好。

2.5 质谱分析法

2.5.1 液相色谱串联质谱联用法

该方法结合了液相色谱（LC）和串联质谱（MS）技术，作为一种高效灵敏的分析方法，已经被广泛应用于生物样品中蛋白质和肽段的检测。LC-MS/MS 可以精确地分离和检测生鲜乳中的乳铁蛋白，并且具有高度的灵敏度和选择性，能够在不同化合物具有相似的分子量或化学结构时，准确鉴定和定量乳铁蛋白的含量。首先需要对生鲜乳样品中的乳铁蛋白进行提取和富集。提取的混合物样品经过液相色谱分离，以将目标蛋白质与杂质物质进行有效分离。分离的乳铁蛋白经过质谱检测，电喷雾离子源（ESI）或者大气压化学电离源（APCI）被用于将样品中的分子转化为气态离子，质谱法检测目标蛋白质的特征离子。最后，通过分析LCMS/MS 数据，采用标准曲线法或其他定量方法来计算含量。

2.5.2 液相色谱高分辨质谱连用法

该方法结合了液相色谱 （LC）和高分辨率质谱（HRMS）技术，具有更高的分辨率和检测灵敏度，能够在不同样品中更准确地鉴别和定量乳铁蛋白，并且可以鉴定可能存在的杂质和同分异构体。与LC-MS/MS方法相似，首先需要将乳样制备成适合LC-HRMS 分析的样品，包括提取乳铁蛋白，去除干扰物质，并将其准备成适合质谱分析的溶液。之后使用液相色谱系统进行分离，这一步骤可以有效地分离乳铁蛋白和其他可能存在于乳液中的成分。分离后的化合物被送入高分辨质谱中进行检测和定量，质谱仪可以提供非常精准的质量测定，以确定乳铁蛋白的存在和含量。最后，通过对质谱数据进行分析，可以确定乳铁蛋白的存在和含量，一般通过比较样品中的乳铁蛋白与对照标准或数据库中的已知数据进行鉴定。

2.6 光谱分析法

通过测定样品的吸收、发射或散射光谱，可以定性和定量分析乳铁蛋白。光谱分析法具有快速、简单、无需样品前处理等优点，可以用于快速筛查和检测乳铁蛋白。分光光度法是利用物质对特定波长的光吸收、透射或发射的特性进行定量和定性分析的一种方法。在检测生鲜乳中乳铁蛋白时，分光光度法可以作为一种可行的定量分析方法。其工作原理是利用乳铁蛋白在特定波长的光下的吸光度与其浓度成正比的关系。具体地，对于生鲜乳样品中乳铁蛋白的检测，首先需要准备一定浓度的乳铁蛋白标准溶液，然后通过将标准溶液和待测样品一同置于分光光度计中进行测量。在特定波长下，分光光度计会记录标准溶液和待测样品的吸光度。利用标准曲线法或其他定量分析方法，能够推导出待测样品中乳铁蛋白的浓度。研究表明，分光光度法在生鲜乳中乳铁蛋白的检测中具有成本低、操作简便等优点，并且也可用于大批量检测。但需要注意的是，由于生鲜乳中乳铁蛋白含量较低，可能需要一定的前处理步骤和高灵敏度的仪器来进行准确检测。

2.7 生物传感器检测技术

生物传感器是一种能够将生物学事件转化为可测量的信号的装置，常用于检测和监测生物分子、细胞和微生物。在乳铁蛋白检测中，生物传感器具有高灵敏度、快速检测、实时监测和易于操作的特点。生物传感器能够以非常低的浓度检测乳铁蛋白，即使在微量水平，也能够实现高度灵敏度和特异性的检测。具有实时监测的能力，可以快速响应乳铁蛋白的变化，适用于生产线上对乳铁蛋白含量的连续监测。利用生物传感器的特点，能够在短时间内完成对乳铁蛋白的检测，有助于迅速获得生鲜乳产品的质量信息。生物传感器技术可以被集成到便携式检测设备中，因此能够在现场、农场或者生产线上进行快速检测，实现迅速的质量控制。李琪等[9]利用高特异性抗原-抗体免疫反应，结合磁纳米技术构建了一种能够高效分离检测乳粉体系中的乳铁蛋白的生物传感器。并对市售婴儿乳粉中乳铁蛋白含量进行测定，结果与用高效液相色谱法检测结果相差不大。

3 结论

乳铁蛋白不仅作为一种生物活性物质在人体健康中扮演重要角色，而且是乳制品质量控制和商品价值评估的重要指标。由于生鲜乳和乳制品中乳铁蛋白浓度较低，且矩阵复杂，存在大量的蛋白质、脂质和其他小分子物质，这些都会干扰乳铁蛋白的检测。因此，要求检测方法具有高选择性和灵敏度。目前方法主要存在的问题是操作复杂、成本高、检测时间长或灵敏度和特异性不够。未来的研究可能会集中在简化检测流程、降低成本和提高检测速度方面。纳米技术和生物传感器的开发将有助于实现高灵敏度和高特异性的快速检测。同时，将传统分析技术与高通量技术结合，比如微流控芯片和液相色谱串联质谱（LC-MS/MS），可能是未来检测方法发展的重要方向之一。总的来说，随着新型高通量、高精度的分析仪器和技术的发展，乳铁蛋白的检测方法将趋向于快速、简便、低成本和高准确性，以满足现代乳业和公共卫生的需求。