煮沸裂解法快速提取Tg2576小鼠DNA

于东明 王思谦 范媛媛 邓锦波△

河南大学医学院 1）神经生物学研究所 2）护理学院 开封 475004

Tg2576小鼠，即APPSWE转基因小鼠，是一种研究阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）病理变化及治疗的常用转基因动物模型。该模型鼠在Aβ的沉积、淀粉样斑块的形成、神经元退变和记忆丢失等方面表现出许多与AD患者的相似性［1－2］。对其子代鼠进行准确快速的基因鉴定，是该鼠保种、繁育以及进行下一步AD研究的基础。李国营等［3］采用的单一引物PCR来检测子代鼠的基因型和本实验室在实验中引入内源性参照引物β－actin以减少假阴性结果而采用的双重引物PCR鉴定基因型［4］，是目前对该转基因鼠基因型鉴定的常用方法。但是，无论单一引物或者双重引物PCR鉴定子代鼠的基因型，都是采用的酚／氯仿法提取DNA，该方法步骤繁琐，耗时较长。本研究借鉴煮沸裂解法制备质粒DNA方法，改进后用于提取Tg2576转基因小鼠体细胞DNA，力图建立一种快速、简便、高效的DNA提取方法，为进一步的AD实验研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂 APPSWE杂合子鼠（Tg2576，美国Taconic公司），购自南京大学模式动物研究所。待鉴定子代鼠，由雄性Tg2576与雌性C57BL／6小鼠交配而得。

2×PCR Mix、DNA marker DL2000购自广州东胜生物科技有限公司；PCR引物由上海生工生物技术有限公司合成；Du Red核酸染料（EB替代品）购于北京泛博生物化学有限公司；其他试剂为Sig ma产品或国产分析纯。

1.2 体细胞DNA的提取

1.2.1 酚／氯仿法：第1天：子鼠出生后10 d，剪0.5 cm 鼠尾置1.5 mL离心管内，编号。加0.5 mL DNA提取缓冲液（0.15%SDS、15 mmol／L NaCl，15 mmol／L Tris－HCl、15 mmol／L EDTA、20 mg／L 胰 RNA 酶），加5μL 10 mg／mL蛋白酶K，55℃消化过夜。

第2天：将消化好的组织充分摇匀；每管加入250μL（1／2消化液的体积）饱和氯化钠溶液；混匀，离心，12 000 rp m，10 min（此时会见到很多白色的沉淀，这些都是蛋白沉淀）；转移400μL上清至新的标记好的1.5 mL EP管内；加入800 μL无水乙醇（2倍于上清的体积），上下颠倒混匀，此时应可看到白色絮状的DNA沉淀；离心，12 000 r p m，5 min；弃去上清；加入800μL 70%乙醇；离心，12 000 rp m，5 min；弃去上清；自然晾干，不少于30 min；加入200μL TE，可放入37℃助溶；按需要取适量DNA进行后续PCR操作；短期4℃保存。

1.2.2 煮沸裂解法：首先配 A、B两种裂解液。A液：NAOH 1 g，EDTA二钠0.093 g，纯水加至1 L；B液：Tris－HCl 6.3 g，调p H 3.0，纯水加至1 L。所配裂解液可取100 mL置室温作为日常使用，其余放在4℃保存。

取上述酚／氯仿法所用同几只小鼠，剪0.3～0.5 cm鼠尾置1.5 mL EP管内，编号与酚／氯仿法一致。每个EP管内加入75μL A液，100℃沸水浴45 min；煮好后取出至凉，在EP管内加入225μL B液，漩涡震荡数秒，离心，10 000 r p m，2 min，取上清液；按需要取适量DNA进行后续PCR操作；短期4℃保存。

1.3 PCR 反应

1.3.1 引物：采用Tg2576小鼠的特异性引物（APP引物），上游引物：5’－CTG ACC ACT CGA CCA GGT TCT GGG T－3’；下游引物：5’－GTG GAT AAC CCC TCC CCC AGC CTA GAC CA －3’。

1.3.2 PCR扩增：两种方法所提DNA采用同条件PCR反应体系扩增。采用50μL PCR体系，包括：待测DNA 2μL、APP引物上、下游（10μm）各2μL、2×PCR Mix（组分：100 mm KCl、20 mm Tris－HCl、3 mm Mg Cl2、400μm d NTP混合物、0.1 U／μL Taq DNA聚合酶、溴酚蓝以及其它增强剂与稳定剂）25μL、超纯水补足50μL。循环条件：预变性94℃5 min；变性94℃45 s，退火57℃1 min，延伸72℃1 min，共30个循环；最后延伸72℃10 min，4℃保存。

1.4 琼脂糖凝胶电泳 1.2%琼脂糖凝胶电泳，Du Red核酸染料染色，90～100 V，30 min。电泳后的凝胶即放入GE Healthcare凝胶成像系统内拍照，观察PCR结果。

2 结果

在小鼠鉴定过程中，使用酚／氯仿法和煮沸裂解法提取DNA，经PCR反应后，琼脂糖凝胶电泳示基因型鉴定结果二者一致，且PCR产物分子量大小与目的片段均一致（图1）；但前者操作繁琐，至少需2 d完成；而后者操作步骤大大简化，可在1 d内轻松完成，提取DNA所用试剂毒性小、成本低，且提取结果可以与前者方法相媲美。

图1 Tg2576小鼠PCR检测结果

图1 A 酚／氯仿法提取DNA结果；图1B 煮沸裂解法提取DNA结果。M 为DNA mar ker DL2000；3，6，7，8：Tg2576阳性鼠（＋／－）；1，2，4，5：Tg2576阴性鼠（－／－）。

3 讨论

AD是老年人多发的进行性神经退行性疾病，临床主要表现为进行性认知功能下降和近期记忆障碍，目前尚无有效的治疗方法。缺少合适的动物模型是AD研究的主要障碍，构建合适的动物模型对AD的研究至关重要［5］。AD的病因复杂，在家族性老年性痴呆患者（FAD）中已鉴定出多个APP基因的突变位点，其中h APP695双突变（K670 N、M671L，Sweden突变）是 FAD 瑞 典 家系的发病原 因［6］，1996年Hsiao等［1］根据FAD瑞典家系的上述遗传病理特征，构建了转入基因，产生子一代的AD转基因模型鼠，并选育成能稳定遗传APPSWE基因的杂合子鼠Tg2576。

在小鼠基因型鉴定过程中，DNA的提取是关键的一步。酚／氯仿法是DNA的提取中应用较为广泛的方法，其对新鲜样品的提取效果比较好，但使用试剂复杂、步骤繁琐，至少需2 d完成。本实验借鉴煮沸裂解法制备质粒DNA方法，改进后来替代传统的酚／氯仿法，用于提取Tg2576小鼠DNA。电泳结果显示该方法与酚／氯仿法鉴定结果相符，且PCR产物分子量大小与目的片段一致（图1），实验操作简单、不需昂贵的仪器设备、用时短、所用试剂毒性小。本实验成功改进了Tg2576小鼠DNA的提取方法，为进一步的AD实验研究奠定了基础。同时该方法也适用于PCR扩增及后续分析，值得在其他转基因小鼠鉴定实验中推广。

［1］Hsiao K，Chap man P，Nilsen S，et al.Correlative memory deficits，A elevation and amyloid plaques in transgenicmice［J］.Science，1996，274（5284）：99－102.

［2］Kawarabayashi T，Shoji M，Younkin L H，et al.Di meric a myloid beta protein rapidly accu mulates in lipid rafts followed by apolipopr otein E and phosphorylated tau accu mulation in the Tg2576 mouse model of Alzhei mer＇s disease［J］.J Neur osci，2004，24（15）：3 801－3 809.

［3］李国营，张革，胡金家，等 .APPSWE转基因鼠的繁育及子代鉴定的研究［J］.中国病理生理杂志，2004，20：113－116.

［4］范文娟，程维杰，牛艳丽，等 .双重引物PCR鉴定APPSWE转基因小鼠［J］.神经解剖学杂志，2009，25（1）：84－86.

［5］赵荷剑，张善锋，高林 .酸性肽对AD大鼠学习记忆功能及NGF和NMDAR1表达的影响［J］.中国实用神经疾病杂志，2009，12（1）：11－14.

［6］Cai XD，Golde TE，Younkin SG.Release of excess amyloid protein from a mutant amyloid protein precursor［J］.Science，1993，259（5094）：514－516.