大鼠脑损伤后暴露于冷环境下血脑屏障通透性变化的研究

习 斌， 万登峰， 梁爱军， 沈晓黎， 邓志峰

近年来，由于极端天气频繁出现，长时间暴露在冷环境下可对机体产生局部的冻伤，特别是四肢冻伤，有学者认为暴露在冷环境下机体的认知功能下降［1］，而对颅脑损伤后暴露于冷环境下血脑屏障内皮细胞紧密连接变化的研究报道较少。本实验采用大鼠颅脑损伤后给予4℃低温环境，用干-湿重法测脑含水量和用镧示踪剂观察脑损伤后血管紧密连接开放状态，探讨大鼠脑损伤后暴露冷于环境对血脑屏障通透性的影响。

1 材料与方法

1.1 动物选择与分组 健康Sprague-Dawley大鼠(雌雄不限)，体重250～350g，共80只，随机分为常温对照组(20只)、冷环境对照组(20只)、伤后冷环境组(20只)、伤后常温组(20只)。每组又按颅脑损伤后取断头标本时间不同分为4个亚组:分别为第1天、第3天、第5天、第7天，每个亚组5只。

1.2 冷环境下脑损伤模型的制备 用10%的水合氯醛(0.35/kg)腹腔内注射麻醉大鼠，麻醉后将其头部固定于立体定向仪上，剪去顶部皮毛，消毒皮肤后沿中线右侧切开头皮，分离骨膜显露右顶骨，用牙科钻于中线旁2mm、人字缝前2mm钻孔，形成一直径约5mm的骨窗，注意保持硬膜完整。采用改进 Feeney，s［2］自由落体打击大鼠脑组织，定制打击器导管引导重锤(40g)从25cm处自由落体，撞击撞针，撞针下陷约2.5mm，致大鼠右顶叶脑损伤。伤后缝合头皮。伤后常温组:大鼠脑损伤后立即置于温度25℃的室温环境中正常喂养。伤后冷环境组:大鼠脑损伤后立即置于温度为4℃的人工气候箱，4h后重新放入25℃室温正常喂养。常温对照组:仅开颅不致伤，置于25℃室温正常喂养。冷环境对照组:仅开颅不致伤，置于温度为4℃的人工气候箱，4h后重新放入25℃室温正常喂养。

1.3 脑组织含水量的测量 各组均于致伤后第1天、第3天、第5天、第7天断头取脑，沿挫伤灶中央冠状面取材(包括对侧未损伤脑组织)，厚约2mm，切取脑组织即刻用10%福尔马林液固定4h。剩下脑组织置于已称重的带盖玻璃称样杯中，用电子分析天平称湿重后置于110℃电热恒温干燥箱内干燥至恒重为止，称量干重，按Elliot公式计算含水量:脑组织含水量=湿重－干重/湿重×100%。

1.4 镧醛固定液的配置 首先量取0.2mol/L二甲砷酸钠缓冲液50ml、10%多聚甲醛水溶液20ml、25%戊二醛原液8ml和适量双蒸水溶解的硝酸镧(2g)溶液，最后双蒸水加至100ml，并缓慢加入0.1mol/L NaOH 并把 pH 调至7.4 ～7.8。

1.5 电镜标本制作 25℃室温条件下，在各时间段仰卧位固定大鼠，迅速打开胸腔，露出心脏，用灌注针头从左心插入主动脉弓，剪开右心房，先用等渗生理盐水冲洗，直至大鼠的血液冲洗干净，随后以镧醛固定液行心脏灌注)固定，15min后开颅，在损伤灶周围4mm内取2～3块脑组织，所取脑组织应大小应小于1mm×1mm×lmm，把标本置镧醛固定液中并放入4℃冰箱8h，用含1%硝酸镧的二甲砷酸钠缓冲液洗涤2次，每次15min，立即用含1%硝酸镧、四氧化锇酸溶液再浸泡脑组织固定3h，按顺序分别用50% 乙醇浸泡15min×1次;用70% 乙醇浸泡15min×1次;用90% 乙醇浸泡15min×1次;用100%乙醇浸泡15min×3次;用纯环氧丙烷浸泡15min×2次;用环氧丙烷+环氧树脂包埋剂1∶1包埋后置于37℃烤箱中1h，再拿出置于纯环氧树脂中放于37℃ 烤箱中4h。再置入塑料胶囊包埋，放进60℃烤箱中48h，用5型超薄切片机，切60～90nm厚的薄片，置于150个网目的铜网上用醋酸铀和柠檬酸铅染色，最后在日立H-600型透射电镜观察并摄片。

1.6 BBB通透性的结果判断 镧通透性按等级分类标准:BBB外未见硝酸镧(+);BBB外有少量硝酸镧();BBB外有中等量硝酸镧();BBB外有大量硝酸镧()。

2 结果

2.1 硝酸镧示宗法 (1)常温对照组:在第1天、第3天、第5天、第7天中，La3+都附着在血管腔内壁，血管外没有镧颗粒渗出，紧密连接无开放，内皮细胞未见肿胀、坏死，毛细血管腔内膜完整、连续、光滑、层次清楚(见图1)。(2)冷环境对照组:与常温对照组基本相同。(3)伤后冷环境组:第1天:血管内可见镧颗粒，并可见大量镧颗粒渗出到血管外神经组织及组织间隙中，内皮细胞中也可见镧颗粒，内皮细胞肿胀，吞饮小泡增多。第3天:可见高密度的镧颗粒通过增宽的紧密连接间隙，通过基底膜到达细胞外间隙(见图2)。第5天:镧颗粒渗透到血管外周围，与第1天和第3天比较，血管腔内见镧颗粒渗出明显减少(见图3)。第7天:仍有少量镧颗粒通过基底膜到细胞外间隙，但比第5天明显少。(4)伤后常温组:各时间段镧颗粒渗出情况基本与常温致伤组相同，都是第1天、第3天渗出达高峰，第5天、第7天持续逐渐减少，但各时间段渗出的量都比伤后冷环境组少，有统计学差异(P＜0.05)(见图4、见图5)分别为第3天、第5天。(5)大鼠脑损伤后血管紧密连接的变化:镧颗粒成直线通过血管壁，血管内皮细胞紧密连接呈开放状态(见图6)。

2.2 脑组织含水量变化 伤后常温组致伤后在第1天时脑组织含水量明显高于常温对照组，脑含水量增高持续至第3天，而第1天、第3天、第5天与同时段的常温对照组比较均存在明显统计学差异(P＜0.05)，伤后第7天仍然高于同时段的常温对照组，但与同时段的常温对照组相比无统计学意义(P＞0.05)。伤后冷环境组在第1天时脑组织含水量明显高于冷环境对照组，伤后第5天开始下降，第1天、第3天、第5天与同时段的冷环境对照组比较均存在明显统计学差异(P＜0.05)，第7天仍然高于同时段的冷环境对照组，但无统计学意义(P＞0.05)。伤后冷环境组第1天脑组织含水量高于伤后常温组，直至增高到第3天，伤后第5天开始下降，第1天、第3天、第5天与同时段的伤后常温组比较均存在统计学差异(P＜0.05)，第7天仍然高于同时段的伤后常温组，但无统计学意义(P＞0.05)。低温对照组与常温对照组各亚组同时段相比无统计学意义(P＞0.05)(见表1)。

表1 各组不同时间段脑组织含水量(%±s)

表1 各组不同时间段脑组织含水量(%±s)

与冷环境对照组比较#P＜0.05;常温对照组比较*P＜0.05;冷环境对照组比较＆P＜0.05;伤后常温组比较△P＜0.05

组别 第1天(n=5) 第3天(n=5) 第5天(n=5) 第7天(n=5)常温对照组冷环境对照组伤后常温组伤后冷环境组77.95 ±0.1577.95 ±0.4481.96 ±0.03*＆82.04 ±0.44#△77.97 ±0.1277.97 ±0.0681.96 ±0.04*＆82.05 ±0.05#△77.98 ±0.0877.97 ±0.0779.77 ±0.39*＆80.55 ±0.35#△77.97 ±0.0977.98 ±0.0678.12 ±0.2078.18 ±0.29

3 讨论

血脑屏障(blood brain barrier，BBB)是介于血液和脑组织之间低通透性且具有一定选择性的动态界面，半径大于1nm的亲水分子仅少量可被动地通过此屏障，故此屏障是机体的一种保护机制，对稳定脑组织内环境有重要意义。BBB是一个非常复杂的细胞系统，它主要由3层结构组成:(1)内皮细胞(EC)层［各EC以紧密连接(TJ)连接］;(2)血管周围的星形胶质细胞;(3)以及基膜(BM)等结构构成，而脑组织毛细血管内皮细胞及其细胞间的紧密连接构成的细胞层是BBB的基础，颅脑损伤后血脑屏障的破坏损伤了血流和脑物质交换的血管内皮细胞层，导致血管中的血浆蛋白和水溶性物质渗透到脑组织中而使脑肿胀、颅内压增高和血管压迫性局部缺血等方面促进脑组织进一步损害［3］。

近些年来的研究表明颅脑损伤后BBB通透性的变化与多种机制有关。郑跃英［4］等认为脑损伤血脑屏障通透性增加可能与水通道蛋4有关;王洪生［5］等认为大鼠脑挫伤后BBB的开放与血管内皮细胞紧密连的中断有关;Castillo［6］等认为基底膜中Ⅳ型胶原、层黏连蛋白和纤黏连蛋白等物质的水解导致血脑屏障的破坏，从而使脑水肿加重。本研究中发现在对照组中镧颗粒未渗透到血管壁外，说明其脑组织没有受到影响，而大鼠颅脑损伤后在各时间点都看到镧颗粒通过血管进入到神经组织中，并可见内皮细胞紧密连接间距增加，因此本实验进一步证实脑损伤后血脑屏障通透性增加与血管内皮细胞紧密连接开放有关。

直接暴露于冷环境下对机体有一定的影响，以往针对冷环境对机体影响的研究有心血管系统、机体代谢、内分泌系统、神经系统等。Westfall等［7］将大鼠置于4℃冷环境7d，发现慢性冷刺激能够提高交感神经紧张度，而较长时间处于寒冷环境中，机体运动神经和感觉神经的功能都会受到抑制。Feng等［8］用冰水刺激大鼠不但引起脑内快速的早期可逆性Tau蛋白磷酸化也导致刺激时间依赖性的迟发型Tau蛋白磷酸化，说明冷环境可能是神经变性疾病的一个危险诱导因素。代大伟［9］等认为33℃ ±0.5℃局部脑温度既通过减轻BBB完整性的破坏在转录水平抑制AQP-4 mRNA表达的增加，也可以在翻译水平直接抑制了AQP-4蛋白质的表达，减轻脑出血后的脑水肿形成。Masahiko［10］等在大鼠脑出血后给予5℃冷环境，发现5℃冷环境能减少脑出血后血脑屏障损害和炎症反应。有研究报道长时间寒冷暴露对正常神经系统的功能产生影响，因此，阐明在大鼠脑损伤后暴露于4℃冷环境下BBB通透性变化的机制具有重要的理论和现实意义。

本研究通过建立大鼠脑损伤后冷环境下的动物模型，用硝酸镧示踪法来验证血脑屏障通透性。正常情况下镧颗粒是不能通过BBB的，只有当BBB破坏后镧颗粒才能通过受损的BBB渗透到血管外。结果发现，常温对照组和低温对照组的血管内皮细胞未见损伤，镧颗粒没有渗透到血管外，而伤后常温组和伤后冷环境组在第1天、第3天、第5天、第7天中都可见血管内皮细胞层紧密连接开放，镧颗粒渗透到血管外，且第1天、第3天渗出最多;第5天、第7天逐渐减少，可提示伤后脑通透性改变在常温与冷环境的高峰期是在第1天、第3天。伤后冷环境组渗出的镧颗粒在各时间点比伤后常温组多，有统计学差异(P＜0.05)，血管内皮紧密连接开放增加，从而促进BBB破坏，进一步加重脑水肿。本次试验也证实了伤后常温组脑含水量与伤后冷环境组比明显较少，有统计学意义(P＜0.05)，因此大鼠脑损伤后暴露于4℃冷环境下可促进紧密连接的开放，增加血脑屏障通透性，进而加重脑水肿，但暴露于冷环境下如何促进血脑屏障内皮细胞紧密连接开放的作用机制有待进一步研究。

图1 常温对照组和冷环境对照组:镧颗粒聚集在血管腔内

图2 伤后冷环境组(第3天):大量的镧渗透到组织间隙中

图4 伤后常温组(第3天):血管外神经组织中可见镧颗粒与(图2)比，镧颗粒显著较少

图5 伤后常温组(第5天):血管外周可见少量镧颗粒与(图3)比较，镧颗粒渗出减少

图6 大鼠脑损伤后血管紧密连接的变化:镧颗粒以直线通过血少管壁，血管内皮细胞紧密连接呈开放状态

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