环介导等温扩增技术在快速检测炭疽芽胞杆菌中的应用

段圣亮，陆晔，田桢干，王桂江

1. 中国人民解放军防化指挥工程学院，北京 102205； 2. 上海出入境检验检疫局，上海 200335

生物恐怖袭击的威胁及其可能造成的灾难一直是国家安全与公共卫生关注的焦点[1]。细菌类生物恐怖病原体毒性强、传染性高、对外界环境的抵抗力强，且较易投放。如炭疽芽胞杆菌、布鲁菌、鼠疫杆菌等都可能作为病原体用于生物恐怖袭击，且它们生存的基质多样化。因此，在国境口岸建立有效、快速、安全的生物恐怖病原体检测技术至关重要。

炭疽芽胞杆菌属需氧芽胞杆菌属，能引起羊、牛、马等动物及人类炭疽病，并在环境中造成广泛污染。由于其芽胞对外界环境具有极强的抵抗力，造成的环境污染常持续存在；而传统的培养鉴定法用时较长，检出率低[2-6]。因此，准确、快速检测炭疽芽胞杆菌具有十分重要的意义。本研究应用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术建立一套检测炭疽芽胞杆菌的方法。其原理是根据炭疽芽胞杆菌特异性基因序列设计内引物、外引物各1对，或再增加环状引物1对，特异性识别靶序列上的独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列形成有很多环的花椰菜结构茎-环DNA混合物。从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物(焦磷酸镁)，形成乳白色沉淀，加入显色液后即可通过颜色变化观察及判定结果[7，8]。

1 材料和方法

1.1 引物设计

PA基因是炭疽芽胞杆菌保护性抗原基因[9-11]，针对PA基因设计引物，见表1。

表1炭疽芽胞杆菌LAMP引物序列表

Tab.1PrimesforBacillusanthracisinLAMP

Prime Sequence Outer F35′-CTGATAGTCAAACGAGAACAA-3′Outer B35′-AGTTCTTTCCCCTGCTAGA-3′Inner FIP 5′-CGCATGCACTTCTGCATTTCTTTTAATACTTCTACAAGTAGGACACAT-3′Inner BIP 5′-TCGTTCTTTGATATTGGTGGGAGTTTTTGATAGTGAATGATCAATTGCGAC-3′

1.2 细菌培养和DNA模板制备

细菌于LB增菌液37 ℃培养过夜，取1 ml菌液置Eppendorf管中，10 000 r/min离心2 min，弃上清液；加入80 μl 无菌水，混匀，沸水浴10 min，置冰上5 min；10 000 r/min离心2 min，留取上清液，-20 ℃保存备用。

1.3 LAMP反应

LAMP反应体系参考Notomi等文献[8]，总体积25 μl，成分为2 mmol/L dNTP、25 mmol/L Tris-HCl、12.5 mmol/L KCl、12.5 mmol/L(NH4)2SO4、10 mmol/L MgSO4、0.125% Triton X-100、1 mol/L甜菜碱、内引物0.2 μmol/L、外引物0.25 μmol/L、8 uBst酶0.5 μl、核酸样品2.5 μl，其余用水补足。加入30 μl矿物油，65 ℃ 60 min，80 ℃ 10 min，加入染料SYBR Green I，以阳性和阴性对照为基准进行目测。

1.4 LAMP结果判定

若与阴性对照管一样显橙色，为阴性；若与阳性对照管一样显绿色，则为阳性(图1)。本研究每次实验各个样本均同时进行2管检测。

1.5 灵敏度实验

取100 μl细菌，接种于5 ml LB中，37 ℃培养过夜；按10倍倍比稀释。每个浓度取1 ml菌液，加100 μl蒸馏水，沸水浴10 min；离心，取2.5 μl上清液，进行LAMP反应，记录出现阳性的最低浓度。同时从10-5、10-6、10-7浓度级中各取100 μl菌液涂布LB平板，每个浓度涂3块，37 ℃培养，计数菌落，估算原菌液细菌浓度。

Left is negative control, and right is positive control.

图1阴性和阳性对照

Fig.1Negativeandpositivecontrols

1.6 特异性实验

取甘油保存的所选菌种，接种于5 ml LB中，37 ℃培养6～8 h；取100 μl菌液转接于5 ml LB中，37 ℃培养过夜；离心，取1 ml菌液，加100 μl蒸馏水，沸水浴10 min；离心，取2.5 μl上清液进行LAMP反应。

1.7 检测条件耐受实验

1.7.1酸耐受实验共3个pH值，在每个pH值下用3种浓度核酸进行检测(1个阴性、1个灵敏度下限、1个灵敏度10倍)。分别配制pH 1(0.1 mol/L HCl)、pH 2(0.01 mol/L HCl)、pH 3(0.001 mol/L HCl)3种酸溶液备用。取300 μl菌液离心富集，用300 μl pH 1酸溶液悬起，并将该溶液按10倍倍比稀释，细菌浓度依次为109CFU/ml、108CFU/ml、107CFU/ml、106CFU/ml、105CFU/ml、104CFU/ml、103CFU/ml。取104CFU/ml(灵敏度10倍)和103CFU/ml(灵敏度)2个浓度，离心后抽提核酸，进行LAMP检测。pH 2和pH 3组按同样步骤操作。

1.7.2碱耐受实验分别配制pH 13(0.1 mol/L NaOH)、pH 12(0.01 mol/L NaOH)、pH 11(0.001 mol/L NaOH)3种碱溶液备用。取300 μl菌液离心富集，用300 μl pH 13碱溶液悬起，并将该溶液按10倍倍比稀释，细菌浓度依次为109CFU/ml、108CFU/ml、107CFU/ml、106CFU/ml、105CFU/ml、104CFU/ml、103CFU/ml。取104CFU/ml(灵敏度10倍)和103CFU/ml(灵敏度)2个浓度，离心后抽提核酸，进行LAMP检测。pH 12和pH 11组按同样步骤操作。

1.7.3盐耐受实验分别配制2 mol/L溶液﹝将2 mol/L NaCl、KCl、Mg(NO3)2、Ca(NO3)2等量混合，每种阳离子含量0.5 mol/L﹞、1 mol/L溶液〔将1 mol/L NaCl、KCl、Mg(NO3)2、Ca(NO3)2等量混合，每种阳离子含量0.25 mol/L〕、0.5 mol/L溶液〔将0.5 mol/L NaCl、KCl、Mg(NO3)2、Ca(NO3)2等量混合，每种阳离子含量0.125 mol/L〕备用。取300 μl菌液离心富集，用300 μl 2 mol/L盐溶液悬起，并将该溶液按10倍倍比稀释，细菌浓度依次为109CFU/ml、108CFU/ml、107CFU/ml、106CFU/ml、105CFU/ml、104CFU/ml、103CFU/ml。取104CFU/ml(灵敏度10倍)和103CFU/ml(灵敏度)2个浓度，离心后抽提核酸，进行LAMP检测。1 mol/L和0.5 mol/L组按同样步骤操作。

1.7.4大分子有机物(黏稠度)耐受性实验分别配制50 mg/ml(5%)PEG20000、5%甘油、100 mg/ml(10%)牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、20 mg/ml(2%)甘酪素溶液，用以系列稀释菌液并进行检测。

1.8 菌种来源

实验用目标菌及对照菌种来自军事医学科学院微生物流行病研究所。

2 结果

2.1 LAMP检测炭疽芽胞杆菌的灵敏度

对接种平皿计数，计算菌液中的细菌含量。炭疽芽胞杆菌原菌液含量为3×107CFU/ml，检测灵敏度可达3×102CFU/ml(表2)，两次检测结果用“/”分隔。

表2LAMP检测炭疽芽胞杆菌的灵敏度

Tab.2ThesensitivityofLAMPindetectionofBacillusanthracis

Dilution of B. anthracis110-110-210-310-410-510-610-7 CFU/ml of bacteria107106105104103102101100LAMP results+/++/++/++/++/++/++/--/-

2.2 LAMP检测炭疽芽胞杆菌的特异性

LAMP能特异性检测炭疽芽胞杆菌，采用本检测体系对2株枯草芽胞杆菌、2株蜡样芽胞杆菌、2株苏云金芽胞杆菌、1株褐黑芽胞杆菌、1株布鲁菌、1株耶尔森鼠疫杆菌、1株炭疽芽胞杆菌进行特异性检测，显示了良好的特异性(表3)。

2.3 检测条件耐受实验

2.3.1酸、碱耐受性实验结果应用以上炭疽芽胞杆菌检测体系进行酸耐受性实验。在基质中加入pH值分别为1、2、3的酸液。结果显示，随溶液酸度增高，检测灵敏度略有降低。降至104CFU/ml，pH值为2、3时仍能检出浓度为103CFU/ml的细菌悬液，但结果不稳定。同时，应用以上炭疽芽胞杆菌检测体系进行碱耐受性实验。在基质中加入pH值分别为11、12、13的碱液。结果显示，加入上述碱溶液，仍能检出浓度为103CFU/ml的细菌悬液。当加入溶液pH值为13时，结果不稳定，对检测灵敏度略有影响(表4)。

2.3.2盐耐受性实验结果应用以上炭疽芽胞杆菌检测体系进行盐耐受性实验。在基质中加入3种浓度的盐溶液。结果显示，3种盐浓度结果全部为阴性(表5)。随后，用离子含量最低的0.5 mol/L条件对各浓度菌液进行LAMP检测，至菌液浓度为108CFU/ml时，2次检测结果阳性、阴性各1次(表6)。

表3LAMP检测炭疽芽胞杆菌的特异性

Tab.3ThespecificityofLAMPindetectionofBacillusanthracis

表4LAMP检测炭疽芽胞杆菌灵敏度的酸、碱耐受实验

Tab.4TheacidandalkalinetoleranceofsensitivityofLAMPinBacillusanthracisdetection

Bacteria concentration (CFU/ml)104103Negative controlpH=1 (0.1 mol/L HCl)+/+-/--/-pH=2 (0.01 mol/L HCl)+/++/--/-pH=3 (0.001 mol/L HCl)+/++/--/-pH=13 (0.1 mol/L NaOH)+/++/--/-pH=12 (0.01 mol/L NaOH)+/++/+-/-pH=11 (0.001 mol/L NaOH)+/++/+-/-

表5LAMP检测炭疽芽胞杆菌灵敏度的盐耐受实验

Tab.5ThesalttoleranceofsensitivityofLAMPinBacillusanthracisdetection

Bacteria concentration (CFU/ml)104103Negative control2 mol/L (Na+, K+, Mg2+, Ca2+)-/--/--/-1 mol/L (Na+, K+, Mg2+, Ca2+)-/--/--/-0.5 mol/L (Na+, K+, Mg2+, Ca2+)-/--/--/-

表60.5mol/L盐溶液对LAMP检测炭疽芽胞杆菌灵敏度的影响

Tab.6Effectof0.5mol/LsaltonsensitivityofLAMPinBacillusanthracisdetection

Bacteria concentration (CFU/ml)1081071061051040.5 mol/L (Na+, K+, Mg2+, Ca2+)+/--/--/--/--/-

2.3.3大分子有机物(黏稠度)耐受性实验结果应用以上炭疽芽胞杆菌检测体系进行黏稠度耐受性实验。选择4种大分子物质，增加基质黏稠度。结果显示，LAMP方法检测灵敏度受基质黏稠度影响较小，检测灵敏度仍可达103～104CFU/ml(表7)。

表7LAMP检测炭疽芽胞杆菌灵敏度的黏稠度耐受实验

Tab.7TheviscoustoleranceofsensitivityofLAMPinBacillusanthracisdetection

Bacteria concentration (CFU/ml)104103Negative controlPEG20000 (5%)+/++/--/-BSA (10%)+/+-/--/-Glycerin (5%)+/++/--/-Casein (2%)+/+-/--/-

3 讨论

炭疽芽胞对外界环境的抵抗力极强，造成的环境污染常持续存在。因此，研制适用于炭疽芽胞杆菌现场的、准确及快速的检测方法有利于及时确定状况，及时给予防护，从而保障国境口岸安全。

传统炭疽芽胞杆菌检测方法由于检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多[3]等缺点，远远不能满足现代检测的要求。而基于免疫学原理的胶体金技术操作方便、报告结果快，但敏感度较低[12]。以聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)为代表的病原核酸检测技术在实际应用中存在一些问题，如普通PCR需要专门仪器，且存在容易交叉污染、操作过程繁琐等缺点。荧光实时定量PCR虽然较好解决了交叉污染问题，并简化了操作过程[13，14]，却需更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测；且荧光探针成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速、简便、成本低廉，但需高质量、高稳定性的单克隆抗体，否则准确度不够或敏感度低，目前只能用作辅助检测手段。因此，及时运用生物技术新成果以满足生物恐怖病原微生物的检测要求有重要意义。在诸多技术中，恒温扩增(isothermal amplification)核酸快速检测技术在病原核酸检测中有长足进步，在此基础上发展起来的LAMP技术具有很多优越性。

LAMP快速检测技术依赖于能识别靶序列上6～8个特异区域的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶(Bst)，在等温条件(65 ℃左右)下可高效、快速、高特异扩增靶序列。与PCR相比，LAMP具有以下优势。①等温：避免了常规PCR对温度、循环特殊要求所带来的种种不便。反应速度快、时间短，使核酸诊断能有效用于快速筛选。②高效、灵敏：通过设计出的特异性环状引物，可进一步提高检测灵敏度，60 min内扩增效率可达109～1010数量级，扩增模板极限可达数十个，甚至单拷贝靶基因核酸。③特异性强：采用4～6条引物，共识别靶基因的6～8个不同位点，保证扩增的特异性。④费用低：不需要昂贵的精密仪器和特殊试剂，仅需恒温水浴。⑤操作简便：不需进行双链核酸预变性，在一管内即可完成全部检测。⑥检测简单：核酸大量合成时产生的副产物——焦磷酸镁沉淀，通过肉眼观察浊度就能判断扩增与否。同时，核酸产物量巨大，加入特定荧光染料后引起肉眼足以辨认的颜色变化，判读结果非常方便。

本文建立的LAMP检测炭疽芽胞杆菌方法，从DNA抽提开始至反应结束，耗时约1.5 h，反应在65 ℃恒温条件下完成。对炭疽芽胞杆菌能特异识别，检测特异性好，灵敏度高(102～103CFU/ml)，达到荧光定量PCR检测水平[14]，无需特殊仪器设备和实验条件，结果判读也方便、快捷。此外，经验证本方法抗干扰能力较强。由此可见，LAMP检测炭疽芽胞杆菌方法简便、快速、灵敏、准确，适合现场检测的要求，在口岸生物恐怖防御工作中具有很好的应用可行性。

另外，在生物恐怖病原体的核酸快速检测技术中，核酸抽提是影响检验结果的关键[15]。炭疽芽胞杆菌的核酸存在于坚固的芽胞中。本研究发现，将菌液进行普通热裂解可将核酸释放于上清液中，加入裂解液反而影响核酸收集。炭疽芽胞杆菌可能存在的基质较复杂，给检测带来影响。LAMP技术对酸性、碱性及黏稠基质有较好的耐受性，高盐环境会影响该反应，可应用核酸抽提试剂盒对核酸进行纯化，尝试利用磁珠特异吸附和解吸附核酸的特性，有效去除盐分，从而达到适合现场操作、方便并快速分离和纯化核酸片段的目的。

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