新型抗结核蛋白亚单位疫苗Ag85A-γ干扰素的免疫效果评价

王爽，杨恩卓，王洪海，沈洪波

复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室，上海 200433

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)引起的严重危害人类健康的呼吸道传染病，被我国列为重大传染病之一。近几年来，耐药结核分枝杆菌的出现及人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)/结核分枝杆菌共感染等因素导致结核病日益严重威胁着人类健康。为预防结核病，全球在91年前就开始推广接种卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)，但长期临床实践和流行病学证据表明，BCG的免疫保护效果并不理想，保护力在不同人群之间差异很大，且对成年人基本没有保护效果。因此，急需发展新型的疫苗来有效预防结核病。

亚单位疫苗具有组分明确、安全性好、制备简单、可用于成人强化免疫等明显优势，是非常理想的候选结核病疫苗之一。亚单位疫苗有2种形式：蛋白质疫苗和核酸疫苗[1,2]，其中蛋白质疫苗较为安全，易被人们接受。目前，已有超过20种的不同抗原用于诱导抗结核的免疫应答[3,4]。分泌性抗原Ag85A 属于Ag85 蛋白家族(包括A、B、C 和D 4种蛋白)成员之一，同时具有分枝菌酸转移酶和酰基转移酶功能[5,6]，有较好的免疫原性，与结核分枝杆菌潜伏状态密切相关。利用该蛋白开发的新型疫苗可能在应对潜伏感染方面有重要作用，且表达Ag85A 的安卡拉痘苗病毒疫苗已进入临床试验阶段[7]。结核分枝杆菌是一种兼性胞内寄生菌，机体对它的抗感染免疫以细胞免疫为主。在抗结核分枝杆菌感染中，CD4+和CD8+T 细胞起主要作用。结核分枝杆菌活化的T细胞释放出的淋巴因子，包括γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)和白细胞介素2(interleukin 2，IL-2)等在抗结核分枝杆菌感染中起重要作用。

本研究将用来源于结核分枝杆菌重要抗原Ag85A 的成熟蛋白编码基因和细胞因子IFN-γ 基因进行融合表达，通过基因工程手段获得去除信号肽的融合蛋白Ag85A-IFN-γ。用该蛋白皮下免疫小鼠并进行免疫效果评价，结果发现，Ag85A-IFN-γ能有效刺激小鼠产生抗原特异的体液免疫和细胞免疫反应，且倾向于激发T辅助细胞1型(T helper 1，Th1型)细胞免疫，表明 Ag85A-IFN-γ是有潜力的抗结核新型蛋白亚单位候选疫苗。

1 材料和方法

1.1 材料

TransStart FastPfu DNA Polymerase购自北京全式金生物技术有限公司。T4 连接酶，NdeⅠ和BamHⅠ限制性内切酶购自New England Biolabs。质粒抽提试剂盒和胶回收试剂盒购自Axygen公司。金属螯合亲和层析介质(His·Bind®Resin)和回收柱购自GE公司。Quick StartTMBradford Reagent 购自Bio-Rad公司。异丙基-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-D-thiogalactoside，IPTG)、咪唑、四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine，TEMED)、二甲基三十六烷基铵(dimethyldioctadecylammonium，DDA)和植物凝集素(phytohaemagglutinin，PHA)购自Sigma公司。异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) 抗鼠CD4、FITC抗鼠CD8a购自BioLegend。IgG、IgG1、IgG2a和IgG2c 购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。淋巴细胞分离液来自美国Cedarlane公司。RPMI1640完全培养基购自Gibco公司。胎牛血清购自FCS公司。C57BL/6小鼠购自上海斯莱克公司，饲养于复旦大学动物实验中心。

1.2 方法

1.2.1Ag85A-IFN-γ融合蛋白和单独抗原Ag85A的制备采用基因工程方法构建融合基因重组质粒。根据美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)数据库中结核分枝杆菌Rv3408c基因序列和小鼠IFN-γ基因序列，分别设计引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1)。

经聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增，获得去除信号肽的约894 bp的Ag85A目的片段和约500 bp的IFN-γ目的片段。将融合目的片段Ag85A-IFN-γ克隆到质粒pET-28a的NdeⅠ/NotⅠ位点进行转化。在大肠埃希菌(Escheri-chiacoli,E.coli) BL21-CodonPlus(DE3)-RP 中表达包涵体蛋白，直接利用His·Bind®Resin离子亲和柱对重组蛋白进行纯化，在有变性剂(8 mol/L尿素)存在的条件下纯化得到目的蛋白后，对重组蛋白进行透析复性。

表1本实验使用的引物序列

Tab.1Primersintheexperiment

PrimerSequenceForward primer for gene Ag85A (Ag85A-P1)5′-CATATGCAGCTTGTTGACAGGG-3′Reverse primer for gene Ag85A (Ag85A-P2)5′-GGATCCGGCGCCCTGGGGCGCG-3′Forward primer for gene IFN-γ (IFN-γ-P3)5′-GCGGCCGCTCAGCAGCGACTCCTTT-3′Reverse primer for gene IFN-γ (IFN-γ-P4)5′-GGATCCATGAACGCTACACACTG-3′

1.2.2动物免疫程序C57BL/6小鼠随机分组。将Ag85A和Ag85A-IFN-γ融合蛋白分别与100 μg ﹝溶于100 μl 磷酸缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)中﹞和500 μg的DDA佐剂混合，皮下免疫C57BL/6小鼠；同时，设置PBS组、Ag85A组和IFN-γ组作为对照，对照组参照融合蛋白等摩尔数进行免疫，每组4只小鼠。分别在第1、3、5周各免疫1次，共3次。最后一次免疫2周后，眼眶取血收集血清，然后脱颈处死。

1.2.3酶联免疫吸附试验检验血清中的免疫球蛋白水平采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)分析小鼠血清中IgG、IgG1和IgG2c抗体。收集小鼠外周血，于37 ℃静置4 h，析出血清后，12 000g离心10 min，获得的小鼠血清用于检测血清抗体。抗原为100 μl/孔，浓度5 μg/ml，4 ℃包被过夜。用含Tween-20的PBS(PBST)300 μl/孔，洗3次，每次3 min。加含1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的 PBS，300 μl/孔，37 ℃ 孵育2 h。用PBST 300 μl/孔，洗3次，每次3 min。从1∶100 开始，加入倍比稀释的血清样品，100 μl/孔，37 ℃ 孵育1 h。用PBST 300 μl/孔，洗5次，每次5 min。洗板后分别加入300 μl/孔1∶3 000 稀释的过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG(H+L)，1∶1 000稀释的羊抗鼠IgG1、IgG2a和IgG2c，37 ℃放置1 h，用PBST 300 μl/孔，洗5次，每次5 min。最后加底物液显色。于各反应孔中加入临时配制的底物溶液100 μl，室温放置10 min。于各反应孔中加入50 μl终止液。在酶标仪上，于450 nm处，以空白对照孔调零后测各孔光密度(optical density，OD)值。

1.2.4小鼠脾脏淋巴细胞的分离在无菌条件下取小鼠脾脏后，加入1 ml无菌PBS溶液。用5 ml玻璃注射器针筒内磨砂棒在200目筛网上研磨脾脏后过筛，用5 ml PBS重悬。将重悬的脾脏淋巴细胞悬液加到预备好的等体积淋巴细胞分离液(Cedarlane公司)上层，3 000g常温离心20 min。小心取出中间的淋巴细胞，加入PBS后洗2次。用不含血清的RPMI1640细胞培养液重悬细胞，1 200g离心10 min，去除上清液。最后用1 ml RPMI1640细胞完全培养液重悬，取少许进行活细胞计数。

1.2.5流式细胞术检测CD4+CD8+T细胞取3×106/ml无菌分离的小鼠脾淋巴细胞，置24孔板中，用Ag85A刺激72 h。离心、洗涤细胞后，分别与2 μg FITC标记的CD4荧光抗体和(或)2 μg FITC标记的CD8a荧光抗体于4 ℃孵育30 min。然后洗涤细胞，并重悬于300 μl的流式细胞仪( fluorescence activated cell sorter，FACS)缓冲液中进行检测(用于分析的细胞数目>10 000)，应用CellQuest软件分析结果。

1.3 统计学处理

所有样品同一批次重复检测2次，结果以mean±SD表示，对照t检验，P<0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 融合蛋白Ag85A-IFN-γ的表达和纯化

Ag85A和IFN-γ基因通过PCR分别从结核分枝杆菌H37Rv基因组和鼠源cDNA文库克隆获得。其中Ag85A序列在去除信号肽(1～42个氨基酸残基)的编码基因后，连入pET28a形成重组质粒，转化大肠埃希菌BL21(DE3)细胞，表达Ag85A蛋白，并通过Ni柱纯化， 蛋白电泳图谱见图1。去除信号肽编码基因的Ag85A序列连接IFN-γ序列后，以同样方法表达Ag85A-IFN-γ融合蛋白，并通过Ni柱纯化，蛋白电泳图谱见图2。

1，marker; 2， Ag85A.

图1Ag85A蛋白表达纯化电泳图

Fig.1SDS-PAGEofAg85A

1， marker; 2， Ag85A-IFN-γ.

图2Ag85A-IFN-γ蛋白表达纯化电泳图

Fig.2SDS-PAGEofAg85A-IFN-γ

2.2 融合蛋白Ag85A-IFN-γ可有效刺激小鼠产生体液免疫反应

用ELISA分别检测小鼠血清中IgG (图3)、IgG1(图4)和IgG2c(图5)的效价，观察Ag85A-IFN-γ引起小鼠体液免疫水平的变化。结果显示，经Ag85A与Ag85A-IFN-γ融合蛋白免疫的小鼠，其血清抗体水平明显高于对照组；与单独Ag85A相比，融合蛋白免疫效果更好， 可引起更强的体液免疫。比较IgG、 IgG1和IgG2c的水平可知，Ag85A 与Ag85A-IFN-γ 免疫小鼠血清中 IgG2c 抗体水平均高于IgG1抗体水平(图6)。融合蛋白组IgG2c/IgG1与对照组相比，有显著性差异，显示Ag85A- IFN-γ倾向于引起Th1型细胞免疫。

图3免疫第6周的小鼠血清中IgG水平

Fig.3LevelofserumIgGinimmunizedmiceinducedatweek6

图4免疫第6周的小鼠血清中IgG1水平

Fig.4LevelofserumIgG1inimmunizedmiceinducedatweek6

图5免疫第6周的小鼠血清中IgG2c水平

Fig.5LevelofserumIgG2cinimmunizedmiceinducedatweek6

图6免疫第6周的小鼠血清中IgG2c/IgG1水平

Fig.6LevelofserumIgG2c/IgG1inimmunizedmiceinducedatweek6

2.3 融合蛋白Ag85A-IFN-γ可增强小鼠细胞毒性T淋巴细胞的增殖

通过流式细胞术检测不同免疫组小鼠在免疫3次后脾淋巴细胞抗原特异性T细胞的比例，并对其表面抗原表达进行分析。图7显示，融合蛋白Ag85A-IFN-γ的CD8+/CD4+细胞比对照组所占比例更大，说明融合蛋白更倾向于刺激细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)的增殖。

图7小鼠免疫6周后CD8+/CD4+T细胞比例

Fig.7RatioofCD8+/CD4+Tcellinimmunizedmiceinducedatweek6

3 讨论

本研究成功构建并表达纯化了融合蛋白Ag85A-IFN-γ，且进一步评价了其免疫学效果。本研究体液免疫水平检测显示，融合蛋白组的IgG、IgG1 和IgG2c 均高于单独抗原组，单独抗原组免疫球蛋白水平均高于对照组；且IgG2c 抗体水平均高于IgG1 抗体水平，显示Ag85A-IFN-γ主要引起Th1 型细胞免疫反应。CD8+T 细胞能识别主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ类抗原，在免疫应答中具细胞毒作用，可直接吞噬、杀灭结核分枝杆菌；CD4+T 细胞能识别MHC Ⅱ类抗原，是免疫应答中的Th细胞。所以，CTL 比例越高，其直接杀伤结核分枝杆菌的能力越强。T 细胞表面抗原分析显示，融合蛋白Ag85a-IFN-γ 的CD8+/CD4+细胞比对照组所占比例更大，说明融合蛋白更倾向于刺激CTL的增殖。

Ag85蛋白家族是结核分枝杆菌主要的分泌性抗原，大小为(30～32)×103, 包括4种蛋白成分(Ag85A、Ag85B、Ag85C和Ag85D)，它们是结核分枝杆菌疫苗研究中的重要抗原。Ag85A在潜伏感染的健康个体和BCG免疫的小鼠中具有促进T细胞增殖和分泌IFN-γ的功能，能有效激活细胞免疫[8,9]。对Ag85A抗原的功能研究日益深入，揭示其与结核分枝杆菌细胞壁与脂类代谢的密切关系，暗示其在应对潜伏感染的疫苗研究中具有不可或缺的作用。

Th1型细胞因子作为免疫佐剂，与抗原基因重组并表达融合蛋白，可刺激实验动物产生特异性体液免疫和细胞免疫。结核分枝杆菌抗原Hsp65与IL-2融合形成的DNA疫苗、病毒疫苗，肺炎链球菌表面蛋白PspA与IL-2形成的蛋白亚单位疫苗已有文献报道，显示细胞因子的融合可加强抗原的体液免疫和细胞免疫水平[10-12]。本实验选用的IFN-γ是Th1型细胞反应分泌的最重要细胞因子，在抗结核整体过程中有极大作用，不仅可激活巨噬细胞，酸化吞噬体，还可增强自然杀伤细胞能力，刺激CTL增殖分化。IFN-γ与HIV病毒抗原的融合表达，可明显增强单独抗原的细胞免疫反应[13]。

融合蛋白Ag85A-IFN-γ因激发免疫小鼠的体液免疫和细胞免疫反应更为强烈，可作为一种新型的抗结核候选亚单位疫苗，并为进一步发展结核分枝杆菌蛋白与细胞因子的融合蛋白提供了有意义的基础和参考。

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