一株2011年出现的季节性甲型H1N1流行性感冒病毒血凝素基因特性的研究

沈佳仁，赵百慧，高烨，俞雪莲，王嘉瑜，袁政安，吴凡，谢晓红，陶力新，张曦

1. 上海市疾病预防控制中心，上海 200336； 2. 上海市奉贤区疾病预防控制中心，上海 201400

自1918年以来，流行性感冒(简称流感)病毒在世界范围内曾引起4次大流行，这4次流行均由甲型流感病毒的不同亚型引起[1,2]，且新毒株亚型的出现都迅速取代了原毒株而成为新流行株。不同宿主间流感病毒基因片段重配是造成流感大流行新毒株形成的主要方式；另外，人群免疫压力也是推进流感病毒不断进化的原因。新亚型出现或原流行株在沉寂一段时间后再次出现均应在流感监测工作中引起重视。

甲型流感病毒抗原位点主要位于其膜蛋白血凝素(hemagglutinin，HA)(编码该蛋白的是流感病毒基因片段4)，其头部的5个抗原决定簇(Sa、Sb、Ca1、Ca2、Cb)在抗原性改变中起主导作用。此外，HA蛋白受体结合位点包括190螺旋(190～198)，130环(135～138)，220环(221～228)及这些结构附近的保守氨基酸，它们的变化也影响抗原位点的结构，改变病毒的抗原性[3-5]。HA蛋白中潜在的糖基化位点改变也在一定程度上影响病毒的抗原性。Mishin等[6]研究表明，当带负电荷的糖基化位点位于HA受体附近时，会影响流感病毒HA与其受体的结合。

2009年3～4月，北美人群中出现一种猪源甲型H1N1病毒，后命名为A(H1N1)pdm09，引发了全球流感大流行[7]，而此前流行了30余年的季节性甲型H1N1流感亚型在上海乃至全球流感监测中鲜有报道。2011年，上海市各网络实验室共分离培养类流感标本1 995份，季节性甲型H1N1流感亚型毒株仅1株，分离率为0.05%。在以A(H1N1)pdm09流行为主的季节中，此“返祖”毒株的出现让人们联想起1977年我国重现20余年前 的A/PR/8/34(H1N1)毒株，两者之间是否存在着共同点或关联？该毒株是以低发状态在人群中散在流行还是个别现象？因此，非常有必要对此毒株的基因和抗原进行分析，这不但有助于理解流感病毒不同亚型的更替机制，为揭开该毒株的来源提供依据，而且对流感防控工作和流行病学研究具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 样本来源

A/Shanghai/1167/2011(H1N1)毒株来自于上海市奉贤区疾病预防控制中心哨点医院类流感患者咽拭子流感病毒的分离及培养，近10年来北半球季节性甲型H1N1流感亚型毒株和世界卫生组织(World Health Organization，WHO)疫苗株基因序列均来自于美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的GenBank数据库。

1.2 HA基因序列扩增

采用核酸自动抽提仪(MagNA Pure LC Nucleic Acid Isolation，Roche，USA)提取流感病毒RNA。使用反转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)一步法(QIAGEN OneStep RT-PCR Kit，Germany)对HA、神经氨酸酶(neuraminidase，NA)片段全长进行扩增，引物序列来自http://gsc.jcvi.org/projects/msc/influenza， PCR产物纯化后交送上海博尚生物技术有限公司完成测序。

1.3 序列比对与分析

使用DNAstar7.01软件进行毒株之间的同源性比较，MEGA5.05软件进行序列比对并绘制基因进化树。

1.4 血清标本采集及检测

采集2011年下半年上海市虹口区、闵行区、杨浦区、青浦区健康人群血清共600份，采用血凝抑制(hemagglutination inhibition，HI)试验检测人群中各流感病毒亚型和该毒株的抗体水平。季节性流感病毒亚型效价≥1∶20为阳性，A(H1N1)pdm09效价≥1∶40为阳性。霍乱弧菌滤液、A/四川/SWL1/2009的标准抗原和A/天津津南/15/2009(H1N1)由国家流感中心提供，A/Shanghai/1167/2011(H1N1)抗原为本实验室制备。

2 结果

2.1 HA基因序列和抗原性分析

应用DNAstar7.01软件比对A/Shanghai/1167/2011(H1N1)毒株HA基因序列与既往甲型H1N1流感毒株和WHO疫苗株的基因序列，与其同源性最高的是WHO 2008年疫苗株A/Brisbane/59/2007(H1N1) ，同源性为99.2%；与A/PR/8/34(H1N1)同源性为85.5%。而与WHO 2009年甲型H1N1流感疫苗株A/California/07/2009(H1N1)明显不同，同源性仅为72.4%(表1)。

◆The seasonal influenza A(H1N1) strain isolated from Shanghai Fengxian CDC in 2011. ■A/NewCaledonia/20/1999(H1N1): WHO seasonal influenza A(H1N1) vaccine strain in 2001-2007；A/SolomonIslands/3/2006(H1N1): WHO seasonal influenza A(H1N1) vaccine strain in 2006-2007；A/Brisbane/59/2007(H1N1): WHO seasonal influenza A(H1N1) vaccine strain in 2008-2009；A/California/07/2009(H1N1): WHO A(H1N1)pdm09 vaccine strain in 2009.

图1A/Shanghai/1167/2011(H1N1)与其他来源H1N1流感病毒毒株HA基因片段进化树

Fig.1PhylogenetictreeofHAgeneofinfluenzaA(H1N1)viruses

表1A/Shanghai/1167/2011(H1N1)毒株与WHO疫苗株同源性的比较

Tab.1ComparisonofhomologybetweenA/Shanghai/1167/2011(H1N1)andWHOvaccinestrains

StrainsHomologyA/Shanghai/1167/2011(H1N1) and A/Brisbane/59/2007(H1N1)99.2%A/Shanghai/1167/2011(H1N1) and A/California/07/2009(H1N1)72.4%A/Shanghai/1167/2011(H1N1) and A/NewCaledonia/20/1999(H1N1)96.4%A/Shanghai/1167/2011(H1N1) and A/SolomonIslands/3/2006(H1N1)97.3%A/Shanghai/1167/2011(H1N1) and PR/8/34(H1N1)85.5%

采用MEGA5.05软件Neighbor-Joining法绘制基因进化树。为探讨其可能的禽类来源，在序列分析中加入禽源甲型H1N1基因。从进化树可见，毒株主要分为4个分支，第1分支为季节性流感病毒甲型H1N1亚型分支，主要为2000年以来北半球各地区甲型H1N1亚型毒株，其HA序列相似度高。第2分支为1950年后消失的H1N1毒株A/PR/8/34(H1N1)。第3分支为禽体内分离得到的甲型H1N1毒株。第4分支为2009年引起全球流行的A(H1N1)pdm毒株。A/Shanghai/1167/2011(H1N1)属于第1分支，与WHO疫苗株中的A/Brisbane/59/2007(H1N1)关系最接近(图1)。

A/Shanghai/1167/2011(H1N1)流感病毒HA基因共编码557个氨基酸(图2),其裂解位点为PSIQSR↓GLF，基因含9个潜在糖基化位点，其中8个位于HA1片段、1个位于HA2片段。其氨基酸序列与2009年前WHO流感病毒H1亚型各代表株A/NewCaledonia/20/1999(H1N1)、A/SolomonIslands/3/2006(H1N1)、A/Brisbane/59/2007(H1N1)相比，分别有15、12、4处不同。在这些差异中，其在Sa、Sb、Ca1、Ca2、Cb 5个抗原决定簇的氨基酸差异分别有5、5、2处(表2)，抗原性差异不大，但与新型甲型流感病毒A/California/07/2009(H1N1)代表株差异明显。

图2A/Shanghai/1167/2011(H1N1)毒株HA基因氨基酸序列

Fig.2ThesequencesofaminoacidsofA/Shanghai/1167/2011(H1N1)

表2A/Shanghai/1167/2011(H1N1)毒株与WHO疫苗株抗原决定区的氨基酸差异

Tab.2ComparisonofdifferentaminoacidsitesofWHOseasonalinfluenzaA(H1N1)andA(H1N1)pdm09strains

Amino acid siteSaSbCa1Ca2CbA/Shanghai/1167/ 2011(H1N1)156NGENS160162YRNLLW167187EKEVLVLWGVHH198169TGKNG173206KTL208140WPNHTV14573SVAGWI78A/NewCaledonia/ 20/1999(H1N1)156NGKSS160162YRNLLW167187EKEVLVLWGVHH198169TGKNG173206RAL208140WPNHTV14573SVAGWI78A/SolomonIslands/ 3/2006(H1N1)156NGESS160162YKNLLW167187EKEVLVLWGVHH198169TGKNG173206RAL208140WPNHTT14573SVAGWI78A/Brisbane/59/2007 (H1N1)156NGESS160162YRNLLW167187EKEVLVLWGVHH198169TGKNG173206KAL208140WPNHTV14573SVAGWI78A/California/07/ 2009(H1N1)156AGAKS160162YKNLIW167187GKEVLVLWGIHH198169VKKGN173206QSL208140WPNHDS14573NIAGWI78

2.2 NA基因序列分析

A/Shanghai/1167/2011(H1N1)的NA片段有1 413个核苷酸，GenBank BLAST显示与之同源的99%毒株来自世界各地，并无针对性地指向某一地区，可推导该毒株的NA基因与既往全球流行的季节性甲型H1N1流感病毒亚型NA基因同源性高。将历年WHO疫苗株、A/PR/8/34(H1N1)毒株、禽源性甲型H1N1流感病毒毒株、猪源性甲型H1N1流感病毒毒株绘制系统进化树，结果见图3。在WHO疫苗株中，A/Shanghai/1167/2011与A/Brisbane/59/2007(H1N1)关系最近，与上述其他毒株隶属于不同分支，亲缘关系较远。BLAST和系统进化树结果都表明，该毒株的NA分类为N1。

◆The seasonal A(H1N1) influenza strain isolated from Shanghai Fengxian CDC in 2011. ■A/SolomonIslands/3/2006(H1N1): WHO seasonal influenza A(H1N1) vaccine strain in 2006-2007；A/Brisbane/59/2007(H1N1): WHO seasonal influenza A(H1N1) vaccine strain in 2008-2009；A/California/07/2009(H1N1): WHO A(H1N1) pdm09 vaccine strain in 2009.

图3A/Shanghai/1167/2011(H1N1)与其他来源H1N1流感病毒毒株NA基因片段进化树

Fig.3PhylogenetictreeofNAgeneofinfluenzaA(H1N1)viruses

2.3 健康人群血清学结果分析

对2011年下半年600份各年龄组血清进行流感病毒抗体检测。结果显示，季节性甲型H1N1和A(H1N1)pdm09的抗体阳性率、几何平均效价(geometric mean titer，GMT)分别为29.33%、14.45和51.17%、22.39。A/Shanghai/1167/2011毒株检测阳性率为34.33%，GMT为10.38(表3)。

表32011年下半年健康人群血清流感病毒抗体检测结果

Tab.3Theresultsofinfluenzavirusantibodyinhealthyhumaninthesecondhalfof2011

Age (year)A(H1N1)PositiveGMTA(H1N1)pdm09PositiveGMTA/Shanghai/1167/2011(H1N1)PositiveGMT0-39.17%16.7266.67%32.1238.33%12.755-29.17%14.7360.83%27.3238.33%12.2415- 29.17%14.3960.83%24.2041.67%11.3625-22.50%13.2743.33%17.6123.33%7.62>6026.67%13.5024.17%15.3330.00%8.91Total29.33%14.4551.17%22.3934.33%10.38

3 讨论

HA基因是流感病毒基因中变异最多的片段，其核苷酸变化直接影响流感病毒的抗原性与致病性。Cox等曾对1977～1986年H1N1流感病毒的HA1区进行寡核苷酸图谱研究，发现其基因以每年4～6个核苷酸的速度进化，平均每年有2～3个氨基酸的替换，且年代间隔越久远，变异越明显。A/Shanghai/1167/2011(H1N1)毒株的氨基酸序列与2009年前WHO流感病毒H1亚型各代表株A/NewCaledonia/20/1999(H1N1)、A/Solomon- Islands/3/2006(H1N1)、A/Brisbane/59/2007(H1N1)相比，分别有15、12、4处不同，其变异氨基酸的数量均在上述进化速度内，说明该毒株的抗原性并未发生明显变化。其裂解位点为PSIQSR↓GLF，位点中只有1个单独的精氨酸残基(R)，而一些高致病性毒株HA蛋白裂解位点有数个碱性氨基酸(RXR/KR↓GLF)，可见毒株尚未出现高致病性分子特征。从NA基因的进化树来看， A/Shanghai/1167/2011与2008年WHO疫苗株A/Brisbane/59/2007(H1N1)关系最近，且与其他宿主来源的甲型H1N1和A(H1N1)pdm09属不同分支。结合该毒株HA和NA基因特点，A/Shanghai/1167/2011(H1N1)仍属既往季节性甲型H1N1流感病毒亚型，并不是一种新型甲型H1N1亚型。

A(H1N1)pdm09被证实来源于猪的人禽猪重组株[8]，其进化模式与季节性流感病毒进化模式类似，在抗原性变异上属于抗原漂移，不是一种新亚型出现。这说明越来越多动物已参与流感病毒的变异，成为流感病毒的中间宿主或变异场所。然而在A(H1N1)pdm09流行一段时间后，A/Shanghai/1167/2011(H1N1) 毒株作为既往存在并常年替换流行的甲型H1N1流感病毒毒株，可能原因如下。①毒株是A/PR/8/34(H1N1)类毒株：有文献记载A/PR/8/34(H1N1)这类毒株至今活动于我国人群中，其出现与1977年H1N1毒株重现有关[9]。但从基因进化树中可见，A/Shanghai/1167/2011(H1N1)与A/PR/8/34(H1N1)属两大分支，亲缘关系远，两者同源性也仅为85.5%，推论A/Shanghai/1167/2011(H1N1)并不是A/PR/8/34(H1N1)的类毒株。②毒株是1977年以后甲型H1N1流感病毒的重现：仅从本研究看，在HA基因上A/Shanghai/1167/2011(H1N1)与WHO疫苗株A/Brisbane/59/2007(H1N1)最接近，两者之间抗原位点变化最小，同源性高。因此，大致推断A/Shanghai/1167/2011(H1N1)是既往季节性甲型H1N1流感病毒。③实验室污染：然而上海市奉贤区疾病预防控制中心流感网络实验室自2009年年底才开展流感病毒分离培养工作，届时A(H1N1)pdm09已在人群中广泛流行，实验室未有2009年前季节性甲型H1N1流感病毒毒株资源，其2011年分离的季节性A(H1N1)流感病毒毒株不存在实验室内部污染的可能。

血清学结果显示，A/Shanghai/1167/2011(H1N1)在健康人群中的血清抗体阳性率(34.33%)略高于季节性甲型H1N1流感病毒(29.33%)，而低于A(H1N1)pdm09(51.17%)，说明该毒株是以一种低发状态存在于人群。值得注意的是，毒株的GMT仅为10.38，属于人群中抗体较低水平。一旦其再次成为流感流行株，由于人群的自我免疫水平较低，易感风险将增加。

本文主要针对A/Shanghai/1167/2011(H1N1)的HA基因进行研究，发现其抗原存在一定变异，表明其相应的基因序列有改变。但该病毒株从HA和NA基因上来说，同源性仍与既往季节性甲型H1N1流感病毒接近，其来源仍值得深入研究。有文献显示，H1N1毒株中含有H3N2毒株的内部基因[10]，而H3N2毒株在动物和人群中的涉及面比H1N1毒株广，这不但佐证了甲型H1N1流感病毒是人与禽的重组株，更为后续研究工作指明了方向。A/Shanghai/1167/2011(H1N1)是否在其他基因片段中包含其他流感病毒亚型的内部基因？可以肯定的是，其与2009年肆虐的A(H1N1)pdm09相比，抗原性差异很大。正如既往疫苗难以在2009年起到人群保护作用一样，A(H1N1)pdm09疫苗也难以对甲型H1N1流感病毒起到保护作用。随着A(H1N1)pdm09流行趋势减弱，其他流感病毒亚型的流行会随之兴起，人们不可不防那些曾经出现的流感病毒亚型，它们仍隐秘存在于人群中，伺机重现或在不同种间重组，引发下次流感大流行。我们将继续在耐药和重组方面对该病毒的全基因组进行研究，同时加强对该类毒株在类流感患者中的监测。

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