巨噬细胞在沙门菌感染中作用的研究新进展

王贝贝，吴淑燕，黄瑞

苏州大学基础医学与生物科学学院病原生物学系，苏州 215123

巨噬细胞(macrophage)是由血液中的单核细胞进入组织器官分化而成。作为机体天然免疫的重要细胞，巨噬细胞对感染可发生迅速反应，既能直接吞噬、杀伤病原体而发挥非特异性免疫应答作用，又能参与抗原的摄取、加工、处理并呈递给T辅助细胞(T helper，Th细胞)，启动特异性免疫应答，从而将天然免疫与适应性免疫联系起来，在抗感染免疫中具有非常重要的作用。机体感染后，一方面沙门菌作为兼性胞内菌，被巨噬细胞吞噬、杀伤；另一方面，以巨噬细胞作为庇护场所，抵抗药物、抗体及机体非特异性免疫分子如补体、溶菌酶和防御素等的杀伤。

1 巨噬细胞活化对沙门菌的清除

巨噬细胞作为机体免疫系统的重要细胞，处于静息或非活化状态时并无杀伤作用。在组织微环境中，巨噬细胞的激活受多种因素影响，如入侵病原体的菌体成分及其产物、细胞因子、植物血凝素、寄生虫等的刺激，都会导致巨噬细胞活化并作出迅速应答[1]。活化后的巨噬细胞分化为2个不同亚群：M1和M2。M1即经典活化的巨噬细胞(classically activated macrophage，CAM)，主要通过干扰素γ(interferon γ，IFN-γ)和细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)活化，具有吞噬杀菌、释放炎症介质、呈递抗原和启动适应性免疫应答的功能，是机体抵御外来物质的重要防线。M2即替代性活化的巨噬细胞(alternatively activated macrophage，AAM)。由于活化的诱导物质不同，细胞表面亦出现不同的活化标记而再分为3个亚群：M2a，由白细胞介素4(interleukin 4，IL-4)或IL-13诱导，具有抗炎作用；M2b，由免疫复合物和部分Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)或白细胞介素1受体(interleukin 1 receptor，IL-1R)的激动剂诱导，具有抗原呈递作用；M2c，由IL-10和糖皮质激素诱导，具有很强的免疫调节作用和组织修复能力，但杀灭微生物的功能很弱。

Chakravortty等证明，沙门菌致病岛2(Salmonellapathogenicity island 2，SPI2)可阻止亚硝酸盐在未活化巨噬细胞的含沙门菌囊泡(Salmonella-containing vacuole，SCV)中积累，从而使细菌在巨噬细胞中存活[2]。SPI2在巨噬细胞内的表达依赖反应调节蛋白PhoP。当巨噬细胞被IFN-γ激活后，PhoP及组氨酸蛋白激酶PhoQ (PhoP-PhoQ)的活性可被高浓度的活性氮中间产物(reactive nitrogen intermediate，RNI)抑制，导致SPI2表达受抑，促进SCV成熟，并与溶酶体融合后杀伤入侵细菌[3]。

巨噬细胞对控制和清除宿主细胞中的沙门菌非常重要。当病原体入侵时，巨噬细胞自身及其产物所共有的某些高度保守的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，被巨噬细胞表面的模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)识别，进而将其摄入胞内形成吞噬小体(phagosome)。后者进一步与胞内溶酶体融合，形成吞噬溶酶体(phagolysosome)后通过氧依赖性和非氧依赖性途径等方式消化和清除病原体。此外，细胞因子也发挥极其重要的作用。沙门菌及其产物能增加巨噬细胞中mRNA表达，使其分泌多种细胞因子，如炎症细胞因子IL-1，肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)，IL-6、趋化因子如炎性蛋白1α(inflammatory protein 1α，MIP-1α)、MIP-1β、MIP-2α，以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)。

在氧依赖性途径中，活性氧中间产物(reactive oxygen intermediate，ROI)和RNI是2个主要的效应分子。ROI由吞噬细胞NADPH氧化酶产生，RNI由NOS2基因编码的诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)产生。ROI可介导病原体快速清除，且与巨噬细胞早期杀伤沙门菌有关。在沙门菌感染早期，主要是依赖NADPH氧化酶在吞噬小体中的定位控制其生长。当TNF-α与肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，TNFR)p55结合活化受体后，ROI对胞内菌的杀伤能力增强。在沙门菌感染后期，NOS2依赖性的RNI产物在限制细菌生长中起重要作用。NOS2受IFN-γ、IL-12和IL-18等细胞因子的刺激，表达量显著增加[4]。IL-12是由p35和p40两个亚基组成的异源二聚体。沙门菌感染可导致IL-12 p40在派尔伊结(Peyer)、肠系膜淋巴结、脾和肝中的表达量显著上升，而IL-12 p35的表达不受影响[5]。IL-12的另一个重要作用是诱导自然杀伤细胞(natural killer，NK细胞)和T细胞产生IFN-γ，激活巨噬细胞呈递抗原和杀菌的能力。IFN-γ可调节单核-巨噬细胞，增强TNF-α和IL-12释放，形成级联瀑布效应。IL-18是Th1型细胞因子，在宿主抵御沙门菌感染中发挥重要作用。用抗体中和IL-18可导致动物脾和肝中细菌数量增加，宿主存活率降低。用IL-18干预后，脾和肝中细菌数量降低，宿主存活率上升[6]。与IL-12一样，IL-18可诱导IFN-γ产生，通过激发IFN-γ分泌促进Th1型细胞增殖，进一步诱导TNF-α、IL-1β和IL-8等细胞因子产生，增强机体免疫调节和抗感染的能力。此外，鼠伤寒沙门菌可刺激巨噬细胞分泌IL-10，不仅可抑制细胞的杀菌作用，还可为该菌在细胞中增殖提供良好的宿主环境[7]。

目前，越来越多的研究报道沙门菌可通过诱导巨噬细胞凋亡而逃避机体免疫系统识别，导致机体持续性感染。例如，当巨噬细胞感染了表达Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system，TTSS)的沙门菌，会因被诱导凋亡而无法将其加工处理的抗原呈递给T细胞，但凋亡的巨噬细胞可作为沙门菌抗原的贮存库。旁观树突细胞(dendritic cell，DC)通过摄取巨噬细胞凋亡物质和菌体成分，以主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ类和Ⅱ类分子的形式呈递给T细胞。有趣的是，充当旁观抗原呈递细胞似乎是DC的一个独特功能，巨噬细胞只能摄取沙门菌诱导凋亡的细胞，而不能呈递沙门菌抗原多肽[8]。而Guiney等认为，沙门菌诱导巨噬细胞凋亡是一种特殊的毒力机制，可促进细菌在细胞间传播[9]。凋亡的发生改变了细胞表面结构，从而使受体介导的周围巨噬细胞启动对凋亡细胞的摄取，导致细菌在巨噬细胞间不断扩散和感染。但适度诱导自噬可降低巨噬细胞凋亡率。本实验室研究发现，自噬诱导剂西罗莫司〔雷帕霉素(rapamycin，RAPA)〕干预鼠伤寒沙门菌感染的小鼠巨噬细胞后，细胞自噬程度增强，细胞内活菌数及其所致的巨噬细胞凋亡率明显降低，提示调控细胞的自噬水平可降低宿主凋亡率，有利于增强机体抗感染能力[10]。此外，天冬氨酸半胱氨酸特异性蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific protease 1, caspase-1)的活化也可抑制沙门菌诱导的巨噬细胞凋亡，它可启动细胞pyroptotic样死亡，分泌促炎症细胞因子IL-1β和IL-18, 通过招募和激活免疫细胞有效清除胞内病原菌[11]。Pyroptotic是一种促进炎症的细胞死亡程序，可应对多种威胁，包括代谢应激和细菌感染等，具有快速损坏细胞膜的完整性，导致细胞溶解并释放促炎物质的特点。

2 巨噬细胞作为沙门菌感染的宿主

沙门菌是一种兼性胞内菌，侵入机体后主要寄居在单核-巨噬细胞中。沙门菌有毒株能侵袭小肠黏膜，经回肠黏膜上M细胞(microfold cell)进入机体。其步骤是细菌黏附、细胞肌动蛋白重排和内在化、细菌在吞噬泡内繁殖释放并再次被固有层中的巨噬细胞吞噬，如此循环往复。沙门菌的黏附和入侵由染色体中的侵袭素基因inv介导。

沙门菌导致的系统性感染依赖于在专职吞噬性细胞中存活的能力。这个过程是复杂的，包括改变细菌表面结构以抵抗天然免疫的破坏，感知宿主的吞噬体环境，通过吞噬小体重塑而使宿主形成有利于细菌增殖的胞内环境等。沙门菌对机体的毒力主要由2种TTSS介导，分别由SPI1和SPI2编码，通过分泌蛋白或直接将毒力蛋白注入宿主细胞发挥致病作用。一旦细菌毒力蛋白进入胞内，宿主细胞功能如细胞骨架、膜运输、信号转导和细胞因子基因表达等发生改变，以利于细菌在其中生存和增殖。尽管TTSS高度保守，但这2个系统的效应蛋白却是独一无二的。2种分泌系统都与细菌胞内增殖有关，SPI1编码的TTSS在细菌侵袭的初始阶段发挥重要作用，可通过抑制巨噬细胞前炎症因子表达[12]、诱导细胞骨架重排启动大胞饮等作用，实现细菌侵袭，是多种动物和人类胃肠炎的重要致病因素[13]。SPI2编码的TTSS及其效应蛋白与沙门菌的系统感染有关，它可通过调节细菌在胞内转移、抑制吞噬体成熟和抵御宿主杀伤机制等方式，确保细菌在巨噬细胞内生存和生长[14]。SPI2按基因结构功能分成两部分：一部分包含编码双组分调控系统的基因(ssrA和ssrB)、编码TTSS的结构成分基因ssa、效应蛋白基因sse和伴侣蛋白基因ssc；另一部分包含编码连四硫酸盐还原酶的基因(ttrA、ttrB、ttrC)和双组分调控系统基因(ttrR、ttrS)，与沙门菌的系统性感染无直接关系。研究表明，SsrB是沙门菌毒力基因的重要调节子，且SsrB能激活srfN基因，并直接控制其在细胞内的感染[15]。SseA是SPI2依赖性转移蛋白SifA和PipB所必需的，SifA与沙门菌在细胞质内的生存和复制密切相关。SpiC蛋白可干扰SCV在细胞内的运动并阻止其与溶酶体融合，从而避开胞内降解途径。而spiC突变后再感染巨噬细胞时，细菌致病性及生存能力大大降低[16]。

此外，沙门菌能感知宿主的胞质pH值，SPI2编码的TTSS pH传感器在中性环境中构象发生改变，引起SsaM/SpiC/SsaL调控复合物降解，从而导致效应蛋白易位，而酸性环境可防止复合物降解和效应蛋白易位[17]。不仅如此，Lee等最新研究发现，宿主细胞的酸性环境还可引发胞质ATP水平上升，而ATP含量变化激活沙门菌毒力基因，促进毒力蛋白表达，从而使沙门菌在宿主中得以存活[18]。

除致病岛外，沙门菌的其他毒力基因对其在巨噬细胞内的进一步生存也很重要，如携带spv基因的沙门菌不仅能抵抗和逃逸宿主的免疫防御，还能通过抑制自噬、促进凋亡而加重感染[19]。另一种调节基因tdcA突变后，会影响鞭毛和PhoP调节蛋白，使沙门菌在巨噬细胞内存活数量下降[20]。脂质A的变构对于沙门菌在胞内生存也至关重要。脂质A钝化酶LpxR可通过3′-O-脱酰作用对其进行修饰，从而降低其毒力，导致巨噬细胞内生长的LpxR缺陷株数量明显低于野生株。此外, 当感染LpxR缺陷菌株时，它还可增强胞内iNOS表达水平，说明脂质A的3′-O-脱酰作用促进沙门菌在胞内生长[21]。

3 结语

沙门菌作为一种兼性胞内菌，在宿主体内主要寄居在单核-巨噬细胞内。在与宿主细胞长期相互作用的过程中，沙门菌已进化出一套精密的调控系统，不但具备抵抗溶酶体酶、抑制吞噬体-溶酶体融合、干扰ROI等逃避巨噬细胞杀伤的防御机制，而且可以巨噬细胞作为感染过程中的宿主，在细胞内形成SCV。这不仅有利于细菌存活，还可有效逃避宿主的免疫应答。因此，更深入了解巨噬细胞在沙门菌感染过程中的作用，将有助于探索沙门菌所致疾病的发生、发展与转归，同时为预防和治疗提供新的思路和对策。

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