对乙型肝炎病毒耐核苷(酸)类似物机制的新认识

范志远，于德敏，张欣欣

1. 上海交通大学医学院瑞金临床医学院医学系，上海 200025； 2. 上海交通大学医学院附属瑞金医院感染科，上海 200025

抗病毒是目前治疗慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)的重要手段，主要药物有干扰素类和核苷(酸)类似物，后者包括L-核苷(酸)类的拉米夫定(lamivudine，LAM)和替比夫定(telbivudine，LdT)、无环磷酸盐类的阿德福韦酯(adefovir dipivoxil，ADV)和替诺福韦酯(tenofovir disoproxil fumarate，TDF)、环戊烷/烯类的恩替卡韦(entecavir，ETV)[1]。核苷(酸)类药物因具口服方便、不良反应少、应答率高等优点而广泛使用，但主要缺点是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)对部分核苷(酸)类药物累积耐药的发生率较高，且需长期甚至终身服药。现就近年来有关CHB治疗中HBV对核苷(酸)类似物耐药机制的研究进展作一综述。

1 对核苷(酸)类药物耐药通路的新认识

1.1 M204I/V通路

有关研究表明，YMDD突变(rtM204I/V)相关通路或称M204I/V通路是HBV对L-核苷(酸)类药物耐药的主要通路，与其他药物无明显相关性[2]。但M204I/V并非HBV耐LAM的唯一通路，也并非只在HBV耐LAM中起作用。已有研究发现，L80I、V173L、A181V/T等通路亦可作为HBV对LAM耐药的通路[3-6]。另外的研究则显示，M204V 通路与HBV耐ETV相关[7]，M204I通路则与HBV耐LdT相关，且为HBV耐LdT主要通路[8]。

因此，M204I/V通路是HBV对LAM、ETV、LdT发生交叉耐药的重要通路，即一旦HBV对LAM产生耐药，用ETV及LdT替代治疗也可能面临失败。

1.2 L180M、V173L与L80V/I通路

已有研究表明，rtL180M、rtV173L及rtL80V/I突变往往并不单独存在，而是伴随rtM204I/V突变出现，且这些突变通常起代偿作用，可恢复HBV DNA聚合酶因rtM 204I/V突变而降低的复制适应性[9]。另2项研究[10,11]也显示，rtM204I/V与rtL180M、rtL80V/I在HBV对L-核苷(酸)类药物耐药发生中有很强的关联性。

据目前研究，L180M、V173L、L80V/I这3条通路的主要作用是对M204I/V通路起代偿补充作用，协助M204I/V通路在HBV对L-核苷(酸)类药物耐药机制中发挥重要作用。

1.3 N236T与I233V通路

Angus等[12]及Hadziyannis等[13]均在ADV治疗期间发生临床耐药的患者HBV中发现了rtN236T和rtA181V/T突变，且两者与HBV耐ADV明显相关。另外，Osiowy等于2006年的研究也得出类似结论[14]。这些研究提示，HBV耐ADV的发生与N236T、A181V/T通路密切相关。

rtI233V是发生于rtN236T附近233位点上的一个突变，目前对该突变的功能意义知之甚少。之前有研究显示，rtI233V也可能在HBV耐ADV中发挥一定作用[15]。然而，I233V通路与HBV耐ADV是否确切相关尚有待进一步证实。

1.4 A181V/T通路

如前所述，A181V/T通路与HBV对ADV耐药发生相关。Zoulim等于2008年的一项研究也发现，181位点的突变在HBV对LAM和ADV耐药发生中起重要作用[16]。Locarnini 在此基础上进一步指出[17]，A181V/T通路为HBV对所有核苷(酸)类药物耐药共有的原发性通路。可见，A181V/T通路是一条非特异的通路。

1.5 其他耐药通路

除上述几条主要耐药通路外，V84M/S85A、A194T、V214A/Q215S、P237H、N238D、I169T、T184G/S、S202I、M250V等通路也相继报道，这些通路大多为继发性耐药通路。其中，V84M/S85A、P237H和N238D通路被认为与HBV耐ADV的发生相关， A194T通路与HBV耐TDF的发生相关，T184G、S202I和M250V通路与HBV耐ETV的发生相关，I169T、T184S通路与HBV对LAM和ETV的交叉耐药相关，V214A/Q215S通路则与HBV对LAM和ADV的交叉耐药相关[18]。但关于这些通路的具体临床意义，目前认识仍不多。

1.6 对耐药通路的综合认识

Locarnini于2008年综合了现有HBV耐药通道研究成果，将HBV主要耐药通路总结为五大类[17]：M204I/V、N236T、A181V/T、A181V/T+N236T和L180M+M204I/V±I169T±T184G±S202I±M250V。他进一步指出，M204I/V是HBV对L-核苷(酸)类药物的主要耐药通路；N236T是HBV对ADV耐药的主要通路；A181V/T通路是HBV对所有核苷(酸)类药物耐药共有的原发性通路，为重要的交叉耐药通路，且HBV仅对ETV敏感；HBV对ADV和TDF可通过A181V/T和N236T双重通路发生耐药；HBV可通过仅包含多重耐药位点置换的L180M+M204I/V±I169T±T184G±S202I±M250V通路对ETV耐药[7]。

对耐药通路的新认识为临床合理选用高基因屏障抗病毒药物、预防HBV交叉耐药的发生提供了重要指导意义。

2 对核苷(酸)类药物耐药的分子机制研究

除上述对HBV耐药通路的认识外，有关耐药发生的分子机制也有较多研究报道。HBV DNA聚合酶同源反转录酶三维立体分子模型的构建为阐明这些过程的分子机制提供了很多参考。

2.1 对L-核苷(酸)类药物耐药的分子机制

分子模型研究表明，发生rtM204I/V突变后，HBV DNA聚合酶上结合dNTP的袋状结构的大小及电荷分布均发生改变， LAM与聚合酶间的空间阻力和静电斥力增加，导致两者结合能力下降，最终导致对LAM耐药；发生rtL180M突变后，HBV DNA聚合酶与三磷酸拉米夫定氧硫杂环的亲和力降低，增加该酶脱氧核糖结合位点的局部负电荷，使其对LAM与dCTP的鉴别力增强，保证了DNA复制的可靠性；而位于HBV反转录活性中心附近模板链上的173位点发生rtV173L突变后，聚合酶的聚合效率因复制模板和(或)催化中心结构发生调整而增强[4,19-21]。

上述研究从分子水平揭示了rtM204I/V、rtL180M及rtV173L突变如何在HBV对LAM耐药发生中起作用。需指出的是，这些研究目前都主要集中在HBV对LAM耐药分子机制的研究，对其他L-核苷(酸)类药物如LdT的类似研究少有报道。但目前已有科学家基于活体内HBV对LAM耐药也会对其他L-核苷(酸)类药物产生高水平的交叉耐药，以及对其他L-核苷(酸)类药物耐药由rtM204I/V引起这2个现象，提出HBV对其他L-核苷(酸)类药物的耐药机制可能与LAM相类似的假设[22]，这有待进一步研究验证。

2.2 对无环磷酸盐类药物耐药的分子机制

在研究ADV耐药的分子模型中发现，野毒株聚合酶N236在D区可以与rtS85及ADV的γ-磷酸基团各形成1个氢键，使ADV发挥抑制病毒复制的效应。而发生rtN236T突变后，这2个氢键受破坏， ADV与聚合酶间的静电作用力大大减弱，以致聚合酶对ADV的敏感度显著降低，使HBV对ADV耐药。rtA181V/T突变则可通过B区活性中心外的变构效应引起催化部位构象改变，达到类似效果[16]。这些研究进一步指出，空间上与rtN236T邻近的rtP237H、rtN238T/D、rtV84M、rtS85A等突变位点也可能以类似方式在HBV对ADV耐药发生中起作用。HBV对TDF耐药的分子模型研究表明，rtA194T可通过变构效应影响复制模板与dNTP的结合而导致HBV对TDF耐药[23]。

虽然上述机制能解释聚合酶发生相应改变的HBV对ADV耐药的原因，但在ADV治疗失败的患者中只有少数检测到聚合酶的相应改变[24]，提示尚存在其他HBV耐ADV分子机制。

2.3 对环戊烷/烯类药物耐药的分子机制

环戊烷/烯类药物的主要代表为ETV，但由于其具有高耐药基因屏障的特点[7]，往往需有L180M、M204I/V、I169T、T184G、S202I、M250V等多个突变位点协同发挥作用，才导致HBV对ETV的最终耐药，故这方面的分子模型研究相对于前2类药物来说，显得更为困难。目前为数不多的有关HBV耐ETV分子模型研究表明，169位点和250位点的突变可能主要通过影响反转录酶的引物结合区，促进引物与模板更紧密结合而发挥作用；184位点和202位点的突变则可能通过影响模板结合区域的α螺旋和C区催化天冬氨酸残基的β片层之间的疏水区，进而增强M204I/V突变而发挥作用[25]。

3 HBV基因型与耐药模式

目前已发现，HBV有A～J共10个基因型，我国以基因型B、C为主，欧美则以基因型A、D为主[26,27]。对基因型差异对HBV耐药的影响，近年来开展了一系列的研究，将为今后针对不同人群采取个性化的耐药防治措施提供重要依据。

Wiegand等于2008年研究指出，HBV基因型与干扰素治疗疗效相关，但HBV基因型与核苷(酸)类药物的抗病毒疗效是否相关，尚证据不足[28]。

Locarnini等于2010年的研究成果表明，基因型分布不同可通过影响耐药通路而影响核苷(酸)类药物的抗病毒疗效[29]。该研究结果显示，基因型A主要通过M204V通路发生HBV耐LAM，而基因型B、C、D则主要通过M204I通路发生HBV耐LAM；基因型C主要通过A181T通路发生HBV耐ADV，而基因型D则通过A181V通路发生HBV耐ADV。这一研究说明，不同基因型HBV发生各种耐药性突变的频率并不一致。基因型分布是否也与HBV对ETV及LdT等不同耐药突变的发生频率相关，尚缺乏相关研究资料。

有研究表明，rtM204I/V与rtL180M之间有密切关联[9-11]，Locarnini等[29]对2003～2009年报道的具有不同HBV基因型的262例患者进行rtM204I/V与rtL180M关联性分析。结果发现，基因型A、B、D患者中rtL180M与rtM204I关联的频率较基因型C患者小，而rtL180M与rtM204V关联的频率则正好相反，提示HBV基因型对rtM204I/V与rtL180M的关联性有影响。

4 HBV耐药预防新观念

HBV虽为DNA病毒，其复制却与RNA病毒的反转录复制极其相似。由于该复制极不稳定，所以容易导致耐药突变的产生，包括自然产生和药物诱导产生[18]。HBV耐药的发生实际上是宿主、HBV、药物三者之间相互作用的结果。按照基因屏障学说，仅单位点突变导致的耐药往往比多位点突变导致的耐药更易发生，即HBV对高基因屏障药物往往不易发生耐药。按照药代动力学屏障学说[30]，若某种药物对野毒株和耐药株的复制均具很强的抑制作用，病毒复制就可维持于较低水平，产生耐药的可能性很小，即早期抑制病毒复制能力越强的药物，后续治疗时对其发生耐药的可能性越小。抑制病毒作用越强、越快，对其产生耐药的可能性越小。

以往人们对HBV耐药的认识主要停留于“无复制等于无耐药”，过于强调抑制病毒复制的层面。但最近研究发现，由于HBV基因组结构中S区完全位于P区内，DNA聚合酶的相关耐药突变常同时导致HBV表面抗原、抗体结合域发生重要结构改变，其中包括抗病毒药物相关的潜在疫苗逃避突变(antiviral drug-associated potential vaccine escape mutant，ADAPVEM)。这一突变的产生导致疫苗诱导机体产生的抗体无法执行中和病毒的功能，从而可能对目前开展全球乙型肝炎免疫接种计划带来巨大挑战。因此，HBV耐药的预防不仅要求采取有效抑制病毒复制的措施，还应做到防止ADAPVEM的出现[31,32]。

5 结语

目前，关于CHB治疗中HBV对核苷(酸)类似物的耐药机制，临床与基础研究在分子和基因水平上解释了许多相关现象，但许多认识仍很初步，机体免疫机制在HBV耐药中的作用尚不明确，包括未发现耐药相关基因突变但临床治疗疗效应答不佳的原因。随着研究不断深入，人们将更全面认识HBV耐药的发生过程，从而针对性地进行耐药预防和干预，提高疗效，改善患者的预后。

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