经典碱裂解法质粒大量提取方法的改良

孟宇，李静，孙智峰，李玉恒，李昌盛，林增，李士泽

（黑龙江八一农垦大学，大庆 163319）

一般细胞转染等特定实验需要高浓度及高纯度的质粒DNA，且要求DNA的A260/A280值应控制在1.8～2.0之间。虽然近些年来质粒大量提取试剂盒层出不穷，但大多费用较高，所以目前大多实验室仍以传统的手提方法为主，其中以萨姆布鲁克[1]提出的经典碱裂解法应用的最为广泛。但此方法却仍存在诸多弊端，例如操作复杂、耗时、所得质粒纯度低等，尤其是多次使用有机溶剂容易造成质粒DNA的污染，且易对实验人员构成危害，实验废液也会造成不同程度的环境污染[2]。因此本实验室在经典的碱裂解法基础上，采用物理方法替代化学方法去除蛋白质，从而避免了酚、氯仿等有机溶剂对实验者的危害和对环境的污染，并且对改良前后的碱裂解法及试剂盒法所制备的质粒DNA的效果进行比较。

1 材料和方法

1.1 菌株

大肠杆菌DH5α。

1.2 主要试剂仪器

主要试剂: 溶液Ⅰ：10 mmol·L-1Tris-HCl，pH7.5，50 mmol·L-1EDTA，pH8.0；灭菌后，4 ℃保存。溶液Ⅱ:1%SDS，0.2 mol·L-1NaOH；现配现用，2%SDS，0.4 mol·L-1NaOH母液等体积混均即可。溶液Ⅲ 1.32 mol·L-1醋酸钾，pH 4.8，用醋酸调节pH值。灭菌后，4℃保存。STE溶液。含RNaseA 20 μg·mL-1的TE溶液。琼脂糖。质粒大量提取试剂盒。

主要仪器：0.2 μm滤膜，电泳仪DYY-8B型稳压稳流电泳仪，核酸蛋白定量仪，Gel Doc 2000紫外凝胶成像仪系统，DK-S12电热恒温水浴锅。

1.3 实验方法

1.3.1 质粒DNA的提取与纯化

大提试剂盒法:依照试剂盒说明书的步骤提取质粒DNA。

经典碱裂解法:提取方法主要按文献[1]进行。

改良的碱裂解法:（1）挑取单菌落于含Amp抗生素的LB液体培养基中，37℃120 rpm摇菌过夜，至OD值为0.6，取50 mL菌液在冰上预冷10 min，5000 rpm离心10 min，尽量吸除上清；（2）重复步骤（1）；（3）将所得菌体沉淀用20 mL冰预冷的STE洗涤一次，5000 rpm 离心 10 min，吸除上清；（4）向留有菌体沉淀的离心管中加入冰预冷的Ⅰ溶液2 mL，振荡悬浮菌体；（5）向离心管中加入4 mL溶液Ⅱ（此过程要在冰上进行[3]），温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解，冰预冷3 min；（6）向离心管中加入4 mL溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，5000 rpm离心10 min，吸取上清转至10 mL新离心管中，5000 rpm离心10 min；（7）用注射器吸取上清，0.22 μm 微孔滤膜过滤；（8）向所得滤液中加入0.7倍体积的异丙醇，轻轻颠倒振荡，置于-20 ℃ 10 min；（9）5000 rpm 离心 20 min，吸除上清，向离心管中加入70%的乙醇洗涤沉淀；（10）5000 rpm离心3 min，将离心管敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将离心管中残留的乙醇去除，避免残留的乙醇影响后续的实验，例如酶切、PCR等；（11）向离心管中加入200 uL含RNaseA20 μg·m L-1TE溶液溶解沉淀，37℃水浴10 min；（12）取相同的菌液，在相同的条件下，重复实验三次。

1.3.2 质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳检测

采用琼脂糖凝胶电泳法:制备1%琼脂糖凝胶，将三种方法所提的质粒DNA，各取3 μL进行凝胶电泳，比较三种方法提取质粒DNA的效果。

1.3.3 测定质粒DNA的A260/A280值

将三种方法提取的质粒各取1 uL并稀释100倍，经核酸蛋白定量测定仪测定质粒DNA的A260/A280值和质粒DNA浓度。

2 结果与分析

2.1 琼脂糖凝胶电泳结果

图1为质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳结果：1为经典碱裂解法所提质粒，较清晰，但仍残留较多杂质；2为试剂盒所提质粒，非常清晰，基本无杂质；3为改良后的碱裂解法所提质粒，非常清晰，基本无杂质。

图1 三种方法提取质粒DNA的效果M:marker；1:经典碱裂解法提取的质粒；2:试剂盒法提取的质粒；3:改良后碱裂解法提取的质粒Fig.1 Agarose gel electrophoresis of plasmid DNA prepared with three different methodsM:DL 2000 marker；1:plasmid DNA prepared with traditional alkali lysis method；2:plasmid DNA prepared with reagent kit method；3:plasmid DNA prepared with modified method

2.2 三种方法提取质粒DNA的A260/A280值和浓度

表1为三种方法提取的质粒DNA浓度的比较，从表中可看出：改良后的碱裂解法提取的质粒DNA浓度明显高于经典碱裂解法及试剂盒法。表2为三种方法提取质粒DNA的A260/A280值的比较，从表中可看出：改良后的碱裂解法所提取的质粒DNA纯度均在1.8～2.0之间，明显比经典碱裂解法效果好，而与试剂盒法相差无几，符合细胞转染等特定实验的使用要求。

表1 三种方法提取质粒DNA的浓度Table 1 The DNA density of three method extraction material particle DNA density

表2 三种方法提取质粒DNA的A260/A280值Table 2 The DNA A260/A280 value of three method extraction material particle

3 讨论

实验在经典碱裂解法的基础上进行改良，用其他方法[4-9]提取多数都需要较长时间，而改良后的操作方法可节省时间，最重要的是以物理方法替代用有机溶剂抽提除蛋白质的化学方法。利用滤膜将蛋白质完全去除，同时用异丙醇除去小片段DNA[10]，最后用RNaseA将RNA消化掉，避免了酚、氯仿等对质粒DNA的污染，同时保障了实验者的安全。而且改良后的碱裂解法提取出的质粒DNA的浓度，明显高于试剂盒法及经典碱裂解法，其纯度更是可以与试剂盒法相媲美，并且所需费用远远低于试剂盒的价格。此方法操作简便，用时短，摒除了酚、氯仿的使用，减少对环境的污染，绿色环保。更降低了实验成本，节省资源，可以在实验室中广泛使用，利于实验研究。

在操作过程中需要注意一些问题:（1）操作过程要认真细致，避免细菌及其他物质的污染；（2）过滤之前吸出的离心上清液要尽量减少蛋白质的含量，过滤时速度缓慢，防止滤液经滤膜边缘流过而污染过滤完的滤液；（3）根据实际情况加入足量的RNaseA，并且孵育时间充足，以防RNA消化不完全，对结果造成影响；（4）提出的质粒DNA浓度与所提菌液的新鲜度及菌液中细菌的密度有很大关系，应注意；（5）溶液Ⅱ现用现配，加入溶液Ⅱ后混匀一定要温和，以免污染细菌基因组DNA，此时菌液应变得清亮黏稠[11]，作用时间不要超过5 min，以免质粒受到破坏；（6）加入溶液Ⅲ后应立即混合，避免产生局部沉淀，如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

［1］萨姆布鲁克，D W拉塞尔.分子克隆实验指南［M］.北京：科学出版社，2005.

［2］邓云华，唐庭炼，金爱银，等.一起城市自来水酚污染事件的调查［J］.环境与健康杂志，2002（3）：63.

［3］Isidoro Felieiello，Ganni Chinali.A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from E.coli［J］.Analytical Biochemistry，1993，212：394-401.

［4］陈绍兴，李沁，董艳，等.质粒DNA提取的简便方法［J］.天津农业科学，2009（5）：8-9.

［5］代敏，王雄清，彭成，等.乳牛乳腺炎病原菌的质粒提取及其四环素耐药基因的扩增［J］.中国兽医科学，2009（4）：87-92.

［6］王锦文，李均敏，丁丽亚，等.丙烯酞胺降解细菌质粒抽提方法的比较［J］.台州学院学报，2003，25（3）：58-61.

［7］周鹤峰，邵敏，葛正龙.碱裂解法提取质粒DNA的研究［J］.遵义医学院学报，2005，28（3）：225-227.

［8］姚伟，周会，徐景升，等.质粒DNA小量提取法的改进［J］.应用与环境生物学报，2005，11（6）：776-777.

［9］倪志华，赵晓瑜.碱裂解提取质粒DNA的改进方法［J］.河北大学学报（自然科学版），2005，25（2）：321-322.

［10］R Lakshmi，V Baskar，U Ranga.Extraction of superior quality Plasmid DNA by a combination of modified alkaline lysis and Silica matrix ［J］.Anal Biochem，1999，272（1）：109-112.

［11］S Ehrt.D Schnapp inger.lsolation of plasmids from Ecoli by alkaline lysis ［J］.Methods Mol Biol，2003，235：75-78.