Rho激酶抑制剂Y－27632对人U87胶质瘤细胞侵袭能力的影响

李 涛 薛进展 范 波 杨晋生 古选民 张 峰 郑凤琴 王藓茹

河南科技大学第一附属医院 洛阳 471003

胶质瘤的发病率约占中枢神经系统原发性肿瘤的40%，呈浸润性生长，手术全切除率低，复发率高，多数病理类型对化疗、放疗不敏感。因此，能否抑制胶质瘤的局部侵润成为改善胶质瘤预后的关键。近年来发现细胞Rho／Rock信号转导通路在细胞骨架重组以及恶性肿瘤细胞的侵润和转移等方面具有重要的调节作用［1］。Rho家族是Ras超家族小分子量G蛋白的成员，是一组分子量为20～25KD的鸟苷酸核结合蛋白，具有GTP酶活性。异常活化的Rho家族亦具有启动肿瘤细胞无限增殖、浸润和侵袭转移的能力。其最重要的下游因子是Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho associated coiled coil forming protein kinase），简称ROCK或Rho激酶。本研究用Rho激酶特异性抑制剂Y－27632作用于体外培养的U87胶质瘤细胞，探讨Rho／ROCK信号系统在U87胶质瘤细胞对周围组织侵润中的作用。

1 材料与方法

1.1材料超净工作台（苏州净化集团空气技术公司），二氧化碳培养箱（Harris，美国），倒置显微镜（Nikon，日本），DMEM 培养基（Sigma，美国），胰蛋白酶 （Sigma，美国），胎牛血清（杭州四季青公司产品），Matrigel基质胶（Sigma，美国），人U87胶质瘤细胞株（中科院上海细胞库），Transwell 24孔培养板（corstor corning，美国），Y－27632（SantaCruz公司），Rho－Kinase活性测定试剂盒（Cyelex），DMSO（Sigma，美国）。

1.2实验分组实验分为对照组0mol／L（定义为A组）与实验组，实验组中 Y－27632浓度分别为10、25、50mol／L组（分别定义为B、C、D、E），每组6例，实验重复3次。

1.3细胞培养用含10%胎牛血清、100U青霉素、100U链霉素的DMEM高糖培养基，于37℃、5%CO2培养箱内培养人U87胶质瘤细胞系。

1.4 U87细胞体外浸润实验细胞进入对数生长期后，倒去细胞培养液，用0.25%胰酶消化细胞1min，然后加入10 mL培养液，将细胞吹打成单细胞悬液。将单细胞悬液（1×106）200μL 分别接种在直径6.5mm（Costar，Cambridge，MA）上室内，上室内用质量浓度为0、10、25、50μmol／L的Y－27632处理，实验所用药物质量浓度不影响细胞生长活性。将已接种细胞的Transwell培养板再次培养10h（37℃、5%CO2）。Transwell小室底部带有多聚碳酸脂膜，膜上均匀分布有直径8μm的小孔，并铺有Matrigel基质胶，下室内加入完全培养基。U87细胞将通过侵袭Matrigel基质胶迁移、穿过多孔滤膜，而后附着在滤膜另一面。培养后用0.1%结晶紫染色附着在滤膜下室面的U87细胞，再用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上490 nm测其吸光度值（OD值），从而间接反映细胞数。

1.5统计学处理数据以（s）表示，采用SPSS 17.0统计软件进行方差分析（ANOVA），用Dunnett t检验法比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

Transwell小室测定体外培养U87胶质瘤细胞的侵润能力。U87胶质瘤细胞分别用0、10、25、50μmol／L的Y－27632处理后培养12h。Transwell小室下室侧细胞经结晶紫染色，然后把结晶紫完全洗脱下来。洗脱液用酶标仪在570 nm处测其OD值，间接反应细胞数。其OD值分别为（0.2875±0.0526）、（0.2239±0.0466）、（0.1748±0.0238）、（0.1275±0.0346）。其中当 Y－27632浓度为25μmol／L时其OD值与对照组经统计学处理差异有统计学意义（P＜0.05），50μmol／L时其OD值与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。25μmol／L组与50μmol／L组之间经t检验差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1。

表1 2组OD值统计学比较

图1 不同浓度的Y－27632对U87细胞侵袭能力的抑制（10×10）

3 讨论

ROCK是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，有两种亚型ROKα（ROCKⅡ）和p160ROCK （ROKβ或 ROCKⅠ），可以被GTP结合状态的Rho蛋白所激活，进而磷酸化其底物，在各种类型的细胞活动中介导肌动蛋白纤维张力和局部黏着斑的形成。该类酶的过度表达能通过与上皮钙黏附素（E－cadherin）及其介导的细胞因子间的相互作用破坏细胞间的粘附，促进肿瘤转移。Rho激酶也能通过调节基质金属蛋白酶促进基质降解和肿瘤转移。在此过程中ROCKⅠ与ROCKⅡ通过不同的机制影响细胞骨架的形成和基质降解［2］。Y－27632是Rho激酶活性的特异性抑制剂，对Rho激酶的抑制特异性较其他蛋白激酶如cAMP依赖的蛋白激酶以及肌球蛋白轻链激酶等高200倍，并呈浓度依赖性［3］，对ROCKⅠ和ROCKⅡ抑制的 Ki值分别为0.22和0.30μmol／L［4］。

在以往的实验中，我们报道了由0～100μmol／L不同质量浓度的Rho激酶抑制剂Y－27 632处理U87胶质瘤细胞后，U87细胞生长活性抑制不明显，而ROCK活性逐渐抑制的结果［5］。本实验在Transwell小室底部铺上Matrigel基质胶，进一步模拟体内环境，观察Y－27 632对U87胶质瘤细胞对周围组织侵袭能力的影响。在本实验中50μmol／L时Y－27 632对对照组的抑制结果与对照组相比差异有统计学意义，与作者以前的实验相比差异更为显著，可能的原因有：（1）半透膜增厚，细胞的运动能力进一步抑制；（2）在较高浓度下，细胞的对周围基质的破坏受到抑制更加明显。通过划痕实验的研究结果提示在高浓度的Y－27 632对U87细胞对周围基质降解的抑制作用明显，并且这一作用有赖于对基质金属蛋白酶的调节。因设计所限，本实验未能将“不同浓度Y－27 632对迁移的影响”这一因素从实验结果中去除，有待于改进。最终的结果可能是这两种机制共同受到抑制形成的。

由于中枢神经系统微环境高度复杂，对其调节的环节也同样复杂，故在体外很难准确模拟胶质瘤在体内的侵润及转移，临床的大量资料表明，肿瘤细胞的侵袭有两个路径：（1）沿着有髓神经纤维束进行迁移，这是胶质瘤细胞沿胼胝体和前交叉迁移的主要路径，这样肿瘤可以从一侧半球转移到对侧大脑半球。（2）肿瘤细胞沿着血管基底膜途径侵袭。新生血管的形成是瘤细胞扩散的必要条件，如果肿瘤组织不能获得额外的血流供应则其侵袭性不会超过2cm远的距离，瘤组织仅沿血管外膜侵袭而不破坏血管本身，但可以增加血脑屏障的通透性。其中沿纤维束扩散是高级别胶质瘤最主要的侵袭方式［6－7］。瘤细胞的转移能力应该包括胶质瘤细胞的迁徙能力和对周围基质的破坏者两方面，在这一过程中所发生的复杂反应的机制还未完全阐明，其中既包括瘤细胞对周围组织的作用，也包括外界组织对瘤细胞反应的互动过程，通过现有的技术在体外难以达到。

本实验初步模拟了影响胶质瘤细胞移行障碍和存在周围基质阻碍两方面的基本因素，观察Rho激酶抑制剂对其影响结果。Rho激酶抑制剂Y－27 632对U87细胞的浸润能力有明显抑制这一结果提示：Rho／Rock细胞信号传导通路与胶质瘤细胞的迁移和对周围组织的浸润关系密切，我们可以以此为切入点来逐步揭示胶质瘤的侵润及转移机制，为临床治疗提供基础。

［1］Eleni Makrodouli，Eftychia Oikonomou，Michal Koc，et al.BR AF and RAS oncogenes regulate Rho GTPase pathways to mediate migration and invasion properties in human colon cancer cells：a comparative study［J］.Mol Cancer，2011，10：118.

［2］Oellers P，Schr er U，Senner V，et al.ROCKs are expressed in brain tumors and are required for glioma－cell migration on myelinated axons［J］.GLIA，2009，57：499－509.

［3］akayama M，Amano M，Katsumi A，et al.Rho－kinase and myosinⅡactivities are required for cell type and environment specific migration［J］.Cenes Cells，2005，10：107－117.

［4］Ishizaki T，UehataM，Tamechika I，et al.Pharmacological properties of Y－27632，a specific inhibitor of Rho－associated kinases［J］.Mol Pharmacol，2000，57（5）：976－983.

［5］薛进展，范波，邢群智，等.Rho激酶抑制剂Y－27632对胶质瘤细胞生长与迁移能力的影响［J］.河南科技大学学报（医学版），2010，28：247－252.

［6］蒋传路，江涛，李永利，等 .胶质瘤的侵袭性生长与手术策略［J］.中华神经外科杂志，2004，20：510－512.

［7］Huang XN，Fu J，Wang WZ.The effects of fasudil on the permeability of the rat blood－brain barrier and blood－spinal cord barrier following experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.J Neuroimmunol，2011，239（1－2）：61－617.