皮下注射变应原特异性免疫治疗作用机制

曾雪妮，李　靖

(呼吸疾病国家重点实验室 广州医科大学附属第一医院 变态反应科，广州 510120)

变应原特异性免疫治疗(allergen specific immunotherapy，ASIT)至今已有100多年的历史，从开始用于临床历经数十年的研究，于1998年因其可以改变变态反应性疾病的自然进程，被视为唯一的针对病因的疗法而被世界卫生组织推荐为过敏性疾病的有效治疗方法[1]。随着变变态反应性疾病发病率的增高、变应原疫苗的标准化、治疗程序规范化及长期疗效得到广泛的认识，ASIT近年受到高度重视。李靖等[2]多位专家发表了关于ASIT的治疗共识，以普及和规范ASIT的临床应用。关于ASIT的作用机制一直是备受关注的问题，从20世纪30年代发现“封闭抗体”到目前关于调节性T细胞的研究，也已经有70余年的历史。本文旨在归纳国内外专家发表的研究成果，讨论目前主要的几种ASIT作用机制学说。

调节性T细胞

完成分化的T细胞分成效应T细胞、调节T细胞(T regulatory cell，Treg)和记忆T细胞3类，Treg细胞通常不对抗原的刺激直接反应，而是以效应细胞为作用对象，调控后者介导的免疫应答，在反馈性调节中据核心地位。Treg细胞可分为天然型Treg细胞(CD4+CD25+nTreg细胞)和获得性Treg细胞(aTreg细胞)。CD4+CD25+nTreg细胞在胸腺中产生，占外周血及其他外周淋巴组织中CD4+T细胞的5%～10%，其特异性标志物为叉头状转录因子p3(forkhead Box p3，FOXP3)。有研究证实，FOXP3选择性地表达于人和鼠的nTreg细胞，nTreg细胞表达FOXP3是静息和活化的普通T细胞表达FOXP3的100倍。FOXP3对CD4+CD25+nTreg细胞诱导外周免疫耐受功能的维持起重要作用[3]，其在体外通过细胞间接触发挥对适应性T细胞反应的抑制效应[4]。

aTreg细胞一般在外周由初始T细胞接触树突状细胞(dendritic cells，DCs)提呈的抗原后产生，也可从nTreg分化而来，亦可来自其他初始T细胞，一般不表达CD25分子和FOXP3。aTreg细胞的分化和发挥功能必须有特定细胞因子的参与。aTreg细胞又可分为Ⅰ型调节性T细胞(T regulatory cell 1，Tr1)和辅助T3细胞(T helper cell 3，Th3)细胞，分别通过白介素(interleukin，IL)-10和转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β介导免疫抑制作用。

Radulovic等[5]研究显示，草花粉患者经ASIT后鼻黏膜表达FOXP3的CD4+CD25+T细胞明显增多，同时可检测到表达IL-10的Tr1细胞，且与症状改善相关。Lou等[6]关于变应性鼻炎患儿ASIT的治疗研究也显示，外周血Tr1细胞的上调在ASIT中起了重要作用，提示Tr1细胞可能是变应性鼻炎ASIT成功的有效指标，但并未发现ASIT后患者外周血中CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞增多。Tsai等[7]的研究显示，经过1年屋尘螨ASIT治疗的患者其Treg细胞水平显著高于未进行ASIT的对照组，且NF-κB表达的下调也更甚于对照组。目前，关于nTreg细胞在ASIT中的作用仍无一致的看法，这可能与实验设计、采集标本部位有关。Treg细胞可以在DCs周围聚集，阻止DCs成熟并下调其共刺激分子，以达到免疫抑制效应。 在小鼠实验中，Treg被证实可以通过OX40-OX40L的相互作用抑制肥大细胞脱颗粒[8]。

辅助性T细胞

T细胞的2个亚群Th1和Th2是在20多年前由Mosmann等首先提出的，关于Th2与支气管哮喘的相关性也被报道了近20年。二十世纪末，关于ASIT作用机制的观点是ASIT可以造成Th1Th2平衡紊乱，既由分泌IL-4为主的Th2型转化为分泌γ-干扰素(interferon-γ，IFN-γ)为主的Th1型。然而，上述观点并未得到统一。一些临床实验显示，ASIT后患者Th2反应降低，但Th1反应并未像预想的上调。另外一些研究则发现，ASIT后患者Th1和Th2反应均下降[9]。动物实验观察到Th1反应的存在与临床症状的改善相关，但也并不是所有研究都有相似结果。近年来，免疫偏倚至Th1反应型机制已经被Treg细胞诱导外周T细胞耐受学说所替代。

IgG4抗体

研究证明，ASIT后患者IgE会出现短暂上升、再逐渐下降；但也有研究发现，IgE在ASIT过程中没有任何改变，且IgE的改变与临床症状改善无关。然而，IgEIgG4比例在ASIT后6个月至3年是显著下降的。IgEIgG4比例可作为Th2Treg转化的典型代表，其比例的降低意味着Th2优势向Treg优势转化[10]。

与IgE不同，IgG4在ASIT期间是持续升高的，其水平在停止ASIT治疗后仍可维持很长时间。IgG4活性强，在IgG亚群中具有特殊的结构和功能，IgG4可通过一条重链和附着的轻链进行持续的Fab-臂交换，从而形成“双特异性”[11]。IgG4与其受体Fcγ受体的亲和力低，且不激活补体，可抑制其他同型免疫复合物，从而在ASIT中扮演重要的抗炎作用。肖晓雄等[12]的研究证明，屋尘螨ASIT后，患者IgG4显著上升，且增长水平与治疗时间呈正相关。但亦有研究证明，IgG水平与临床症状改善并不一致。

一般认为，IgG4通过以下及2种机制发挥免疫抑制功能。(1)直接与变应原特异性IgE竞争结合变应原。IgG4可在变应原达到效应细胞结合IgE之前将其捕获，从而防止肥大细胞和嗜碱粒细胞激活，抑制组胺释放。IgG4也可直接与抗原表位相结合，导致其与IgE竞争结合变应原，发挥其“封闭抗体”的功能[13]。ASIT诱导产生的IgG4具有抑制IgE介导反应的功能已被广泛证实。通过流式细胞仪技术测定IgE与过敏原的结合能力发现，ASIT诱导的IgG抗体功能的改变可使IgE与过敏原的结合力下降，这提示ASIT不仅与IgG的数量有关，更与其封闭能力有关[14]。小鼠模型研究显示，IgG4的封闭作用是通过FcγRⅡB介导的[15]。但在1项关于人的“封闭抗体”研究中发现，用抗CD23单抗封锁FcγRⅡB的下游信号并不能抑制IgG介导的封闭功能，这意味着人类IgG发挥封闭功能是通过与IgE竞争抗原实现的，而非小鼠模型的阻断IgE受体信号。(2)阻断IgE的促抗原提呈作用。 van Neerven等[16]研究发现，经过ASIT的患者血清可以抑制IgE通过B细胞的促抗原提呈作用，致使抗原被提成至抗原特异性T细胞的活性减弱，导致T细胞扩增及释放细胞因子减少。

免疫抑制性细胞因子

白介素-10

目前，关于ASIT中发挥抑制性免疫调节作用的细胞因子的研究最为透彻的是IL-10和TGF-β。IL-10由以Th2、巨噬细胞和CD8+T细胞为主的多种细胞产生，具有广泛的抑制促炎性细胞因子的作用[17]，是公认的介导免疫抑制的细胞因子。IL-10以同源二聚体的形式发挥效应，可抑制Th细胞应答及其细胞因子合成、抑制巨噬细胞的抗原提呈能力及其细胞因子的合成，并促进B细胞增殖分化及抗体产生。IL-10可下调IgE依赖的肥大细胞的活性，减少肥大细胞释放促炎性因子，下调嗜酸粒细胞的功能、活性及存活时间，抑制Th0和Th2细胞释放IL-5。IL-10可通过抑制CD2、CD28和可诱导性刺激分子共刺激信号来抑制针对不同变应原的外周T细胞扩增，并在抑制CD28与下游信号分子结合诱导T细胞无能中起重要作用[18]。除了抑制T细胞扩增，IL-10也能通过抑制共刺激分子和下调主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ类分子和下调抗原提呈细胞对单核细胞和DCs发挥抑制效应，且可抑制大量促炎性因子、趋化因子及其受体的表达[19]。IL-10在ASIT期间持续分泌，对IgG4和IgE的调节表现为相反作用，即强烈抑制特异性IgE产生的同时促进IgG4产生，从而降低变应性炎性反应。由此可见，IL-10在同型转化中也起了重要作用。 另外，IL-10还可促进nTreg细胞转录因子FOXP3的表达[20]。致耐受性的DCs诱导Tr1细胞分化必须通过依赖IL-10的免疫球蛋白样转录物-4人白细胞抗原-G途径[21]。

转化生长因子-β

TGF-β主要由淋巴细胞、巨噬细胞和上皮细胞产生，是多功能细胞因子。有报道TGF-β与变应性哮喘的严重程度呈负相关[22]。TGF-β在哮喘中的作用十分复杂，在气道炎性中，TGF-β1由活化的的嗜酸粒细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞等多种细胞产生并同时介导这些细胞因子的抑制作用。有人认为，局部TGF-β主要促进炎性反应发生，而全身性TGF-β则可能具有抑制炎性反应的作用。TGF-β的多功能性表现为可抑制多种类型细胞生长，并刺激另一些细胞的生长；在不同的培养条件下，TGF-β可对同一类细胞即发挥抑制作用也发挥刺激作用。TGF-β能拮抗淋巴细胞反应、抑制淋巴细胞增殖、抑制细胞毒T细胞成熟、抑制巨噬细胞激活、抑制促炎性反应细胞因子，并可作为信号关闭免疫应答及炎性反应，因此将其视为免疫抑制性细胞因子。TGF-β具有强效的调节功能，对CD4+T细胞的自体耐受具有重要意义。TGF-β对T淋巴细胞的调节作用是通过丝氨酸苏氨酸蛋白激酶使转录因子Smad3发生磷酸化，抑制T细胞增殖，同时抑制转录因子T-bet和GATA-3的表达、抑制Th1和Th2的细胞分化，导致T细胞分化时缺少Th1和Th2细胞的极化而造成Treg细胞产生[23]。也可通过FOXP3途径诱导Treg细胞产生[24]。TGF-β对CD4+CD25+T细胞的体内扩增和发挥免疫抑制功能也是必要的[25]。TGF-β可以诱导Treg细胞表达细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4，从而抑制外周T细胞的激活[26]。TGF-β可调节IgE、FcεRⅠ在朗格汉斯细胞(Langerhans cell)表面的表达，导致抗体同型转化为非炎性IgA抗体[27]。

树突状细胞

DCs是目前已知功能最强大的抗原提呈细胞，也是唯一能激活初始T细胞的抗原提呈细胞，是适应性免疫应答的启动者。同时，因其具有诱导免疫耐受的潜在能力，DCs在ASIT中扮演着重要角色。在过去的10余年里，DCs通过促进aTreg细胞的产生，使其在不同变应原引起的免疫反应调节中的重要作用被逐渐认识。

DCs是引发免疫反应还是免疫耐受取决于其成熟阶段，致耐受性DCs是半成熟状态，表达MHCⅡ类分子和CD86较多而表达CD40较少，且缺乏促炎性细胞因子IL-6和肿瘤坏死因子-α[28]，可诱导高分泌IL-10的aTreg细胞产生[29]。DCs在IL-2的参与下可通过抗原依赖或非依赖的互相作用诱导Treg细胞扩增[30]。最近有研究显示，ASIT可加强已经在变应性疾病患者中被损害的DC-TLR9介导的固有免疫反应。这项研究通过对屋尘螨过敏的患者进行ASIT，随后发现孤立浆细胞样树突状细胞诱导的固有免疫反应被重建，导致其对CpG刺激后产生的IFN-γ提升3～5倍[31]。总之，外周血DCs数量和表型的改变与ASIT所致变应性炎性反应的抑制作用密切相关。除此之外，最近的研究还显示，DCs可通过高表达色氨酸分解酶吲哚胺2，3-加双氧酶(IDO)诱导aTreg细胞产生[32]。表达IDO的DCs可在体外抑制T细胞的扩增，在体内促进免疫耐受。而IDO在免疫耐受中的作用是通过诱导Treg细胞表达细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4，也可能通过消耗色氨酸或其代谢产物而直接抑制T细胞扩增[33]。

ASIT对效应细胞的影响

ASIT可有效调节肥大细胞、嗜碱粒细胞的阈值，降低IgE介导的组胺释放[34]。ASIT也可降低募集至炎性部位的活化嗜酸粒细胞，降低嗜酸粒细胞和中性粒细胞释放的嗜酸性阳离子蛋白和其它趋化因子，从而降低气道反应性，使临床症状得以改善。有研究发现，在ASIT的过程中，炎性细胞释放介质(如组胺)虽有减少，但并未停止释放。然而，对昆虫毒液过敏的个体在被叮咬后不会再次出现全身过敏反应则归因于致耐受性组胺受体。目前，已发现了4种组胺受体，其中组胺受体2——HR2通过耦合腺苷酸环化酶和磷酸肌酸第二信使发挥致耐受作用[35]。

结　　语

ASIT可能是目前针对变态反应性疾病最有效的方法，其作用机制主要是通过阻碍DCs成熟，诱导Treg细胞产生，释放大量免疫抑制性细胞因子IL-10和TGF-β，促进B细胞产生抗体同型转化为IgG4，IgG4通过其“封闭抗体”能力及抑制IgE促抗原提呈功能，抑制IgE与效应细胞(肥大细胞、嗜碱粒细胞)表面IgE高亲和力受体FcεRⅠ结合，抑制效应细胞脱颗粒，减少炎性介质的释放，从而达到缓解临床症状的效果。然而，关于ASIT的作用机制仍有许多未被阐明，且不同变应原疫苗及佐剂、不同给药方式都会使ASIT的效果不同。ASIT作用机制的明确将会给治疗带来新的策略，这需要更多临床及实验室研究去探讨。

[1]WHO. Position paper allergen immunotherapy：therapeutic vaccines for allergic diseases[J]. Allergy，1998， Suppl：1-42.

[2]李靖，孔维佳，林江涛，等. 中国特异性免疫治疗的临床实践专家共识[J].中华结核和呼吸杂志， 2012， 35：163-166.

[3]Hori S， Nomura T， Sakaguchi S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor FOXP3[J]. Science， 2003， 299：1057-1061.

[4]Fehervari Z， Sakaguchi S. Development and function of CD25+CD4+regulatory T cells[J]. Curr Opin Immunol， 2004， 16：203-208.

[5]Radulovic S， Jacobson MR， Durham SR， et al. Nouri-Aria. Grass pollen immunotherapy induces Foxp3-expressing CD4+CD25+cells in the nasal mucosa[J]. J Allergy Clin Immunol， 2008，121：1467-1472.

[6]Lou W， Wang CS， Wang Y， et al. Responses of CD4+CD25+Foxp3+and IL-10-secreting type I T regulatory cells to cluster-specific immunotherapy for allergic rhinitis in children[J]. Pediatr Allergy Immunology， 2012， 23：140-149.

[7]Tsai YG， Chiou YL， Chien JW， et al. Induction of IL-10+CD4+CD25+regulatory T cells with decreased NF-kappaB expression during immunotherapy[J]. Pediatr Allergy Immunol， 2010， 21：166-173.

[8]Gri G， Piconese S， Frossi B et al. CD4+CD25+regulatory T cells suppress mast cell degranulation and allergic responses through OX40-OX40L interaction[J]. Immunity， 2008， 29：771-781.

[9]Akdis CA， Akdis M， Blesken T， et al. Epitope-specific T cell tolerance to phospholipase A2 in bee venom immunotherapy and recovery by IL-2 and IL-15 in vitro[J]. J Clin Invest， 1996， 98：1676-1683.

[10] Meiler F， Klunker S， Zimmermann M， et al. Distinct regulation of IgE， IgG4 and IgA by T regulatory cells and Toll-like receptors[J]. Allergy， 2008， 63：1455-1463.

[11] Aalberse RC， Stapel SO， Schuurman J， et al. Immunoglobulin G4： an odd antibody [J]. Experimental Allergy， 2009， 39：469-477.

[12] 肖晓雄，黄东明，崔碧云，等. 屋尘螨脱敏治疗对变应性鼻炎及哮喘患者血清粉尘螨特异性IgG4抗体的影响[J].中华临床免疫和变态反应杂志， 2009，3：34-38.

[13] Mothes N， Heinzkill M， Drachenberg KJ， et al. Allergen-specific immunotherapywith a monophosphoryl lipid A-adjuvanted vaccine： reduced seasonally boosted immunoglobulin E production and inhibition of basophil histamine release by therapy-induced blocking antibodies[J]. Clin Exp Allergy， 2003， 33：1198-1208.

[14] Daeron M， Malbec O， Latour S， et al. Regulation of high-affinity IgE receptor-mediated mast cell activation by murine low-affinity IgG receptors[J]. J Clin Invest， 1995， 95：577-585.

[15] Kepley CL， Taghavi S， Mackay G， et al. Co-aggregation of FcgammaRII with FcepsilonRI on human mast cells inhibits antigen-induced secretion and involves SHIP-Grb2-Dok complexes[J]. J Biol Chem， 2004， 279：35139-35149.

[16] van Neerven RJ， Wikborg T， Lund G， et al. Blocking antibodies induced by specific allergy vaccination prevent theactivation of CD41 T cells by inhibiting serum-IgE-facilitated allergen presentation[J]. J Immunol， 1999， 163：2944-2952.

[17] Conti P， Kempuraj D， Kandere K， et al. IL-10， an inflammatoryinhibi tory cytokine， but not always[J ]. Immunol Lett， 2003， 86：123.

[18] Taylor A， Akdis M， Joss A， et al. IL-10 inhibits CD28 and ICOS costimulations of T cells via src homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase 1[J]. J Allergy Clin Immunol， 2007，120：76-83.

[19] Akdis CA， Blesken T， Akdis M， et al. Role of interleukin 10 in specific immunotherapy[J]. J Clin Invest， 1998，102：98-106.

[20] Karagiannidis C， Akdis M， Holopainen P， et al. Glucocorticoids upregulate FOXP3 expression and regulatory T cells in asthma[J]. J Allergy Clin Immunol， 2004， 114：1425-1433.

[21] Gregori S， Tomasoni D， Pacciani V， et al. Differentiation of type 1 T regulatory cells (Tr1) by tolerogenic DC-10 requires theIL-10-dependent ILT4HLA-G pathway[J]. Blood， 2010，116：935-944.

[22] Gorelik L， Constant S， Flavell RA. Mechanism of transforming growth factor b-induced inhibition of T helper type 1 differentiation[J]. J Exp Med， 2002， 195：1499-1505.

[23] Gorelik L， Fields PE， Flavell RA. Cutting edge： TGF-b inhibits Th type 2 development through inhibition of GATA-3 expression[J]. J Immunol， 2000， 165：4773.

[24] Chen W， Jin W， Hardegen N， et al. Conversion of peripheral CD4+CD25-naive T cells to CD4+CD25+regulatory T cells by TGF-b induction of transcription factor Foxp3[J]. J Exp Med， 2003， 198：1875-1886.

[25] Huber S， Schramm C， Lehr HA， et al. Cutting edge： TGF-beta signaling is required for the in vivo expansion and immunosuppressive capacity of regulatory CD4+CD25+T cells[J]. J Immunol， 2004，173)：6526-6531.

[26] Oida T， Xu L， Weiner HL， et al. TGF-b-mediated suppression by CD4+CD25+T cells is facilitated by CTLA-4 signaling[J]. J Immunol， 2006， 177：2331-2339.

[27] Lutz MB， Schuler G. Immature， semi-mature and fully mature dendritic cells： which signals induce tolerance or immunity? [J]. Trends Immunol， 2002， 23：445-449.

[28] Jonuleit H， Schmitt E， Steinbrink K， et al. Dendritic cells as a tool to induce anergic and regulatory T cells[J]. Trends Immunol， 2001， 22：394-400.

[29] Zou T， Caton AJ， Koretzky GA， et al. Dendritic cells induce regulatory T cell proliferation through antigen-dependent and -independent interactions[J]. J Immunol， 2010， 185：2790-2799.

[30] Tversky JR， Bieneman AP， Chichester KL， et al. Subcutaneous allergen immunotherapy restores human dendritic cell innate immune function[J]. Clin Exp Allergy， 2010， 40：94-102.

[31] Belladonna ML， Grohmann U， Guidetti P， et al. Kynurenine pathway enzymes in dendritic cells initiate tolerogenesis in the absence of functional IDO[J]. J Immunol， 2006， 177：130-137.

[32] Frumento G， Rotondo R， Tonetti M， et al. Tryptophan-derived catabolites are responsible for inhibition of T and natural killer cell proliferation induced by indoleamine 2，3-dioxygenase[J]. J Exp Med， 2002， 196：459-468.

[33] Terness P， Bauer TM， Rose L， et al. Inhibition of allogeneic T cell proliferation by indoleamine2，3-dioxygenase-expressing dendritic cells： mediation of suppression by tryptophan metabolites[J]. J Exp Med， 2002， 196：447-457.

[34] Pierkes M， Bellinghausen I， Hultsch T， et al. Decreased release of histamine and sulfidoleukotrienes by human peripheral blood leukocytes after was Pvenom immunotherapy is partially due to induction of IL-10 and IFNgamma production of T cells[J]. J Allergy Clin Immunol， 1999， 103：326-332.

[35] Meiler F， Zumkehr J， Klunker S， et al. In vivo switch to IL-10-secreting T regulatory cells in high dose allergen exposure[J]. J Exp Med， 2008， 205：2887-2898.