甲型H1N1流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

尹 航，杨焕良，陈 艳，孟沙沙，刘丽萍，辛晓光，陈化兰，乔传玲*

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物国家重点开放实验室，黑龙江哈尔滨150001；2.东北农业大学，黑龙江哈尔滨150030)

猪流感(Sw ine influenza，SI)是由SI病毒(SIV)引起的一种急性高度接触传染性呼吸道疾病。猪被认为是流感病毒的“混合器”，它能够促进禽、猪和人流感病毒的重组，并产生可能引起在人群中大流行的新型病毒株[1]。不同亚型的SIV感染人事件时有发生。2009年爆发的甲型H1N1流感病毒中，SIV提供了多个基因片段[2]。近年来在我国分离的SIV主要包括：经典型(CS)H1N1、北美三源重组型(TR)H1N2、欧洲类禽(EA)型H1N1流感病毒。国内外流行病学调查显示甲型H1N1流感病毒(pdm/09)在猪体内已经适应和流行[3-4]，鉴于猪在流感病毒种间传播中的作用，控制猪群感染甲型H1N1流感病毒的数量，是降低人感染甲型H1N1流感病毒风险最重要的措施之一，而敏感特异的快速诊断方法是实现这一目标的重要手段。实时荧光定量 PCR技术(Real-time fluorescent quantitative PCR，RF-PCR)以其特异性强、灵敏度高、检测速度快等优点，在病原的定性定量检测、基因表达水平分析等方面得到了广泛应用[5]。国外已经开展了RF-PCR检测甲型H1N1方法的研究[6-9]，但其流行病学研究背景与我国有很大不同，国外建立的方法并不能完全适应我国猪群中甲型H1N1流感病毒的检测。因此，建立适合我国SIV流行状况，快速敏感检测甲型H1N1流感病毒的RF-PCR方法，以区别于其他亚型SIV，对于SI的控制及人类公共卫生方面具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 病毒株、质粒和病料 甲型H1N1、古典型猪H1N1、 类 禽 型 H1N1、 类 人 型 H1N1、 H1N2、H3N2、H5N1和H9N2流感病毒由本实验室分离、鉴定并保存；甲型H1N1流感病毒HA基因重组质粒由本实验室构建并保存；鼻拭子采集自广西、天津、广东、黑龙江省不同地区的猪场。

1.2 主要试剂和仪器 M-MLV反转录酶、RNase out购自Invitrogen公司；dNTP、pMD18-T载体等购自宝生物工程(大连)有限公司；RNA提取、质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司；StepOne Software v2.0实时荧光定量PCR仪为美国应用生物系统公司产品。

1.3 RF-PCR方法的建立

1.3.1引物和探针设计根据本实验室分离病毒株以及GenBank登录的甲型H1N1流感病毒HA基因核苷酸序列(JF915184.1)，采用DNAStar软件进行同源性分析，选出高度保守并且特异的核苷酸区域，用 Primer Ex-press 2.0软件设计引物：F Primer：5'-AAATCTAGTGGTACCGAGATATGCA-3'和 R Primer： 5'-GGGAGGCTGGTGTTTATAGCAC-3'， 扩增片段大小为173bp；探针：MGB Taq Man：5'-CA ATGGAAAGAAATGCTGG-3'。

1.3.2RNA的提取及反转录按照试剂操作说明提取病毒RNA。以其为模板，利用流感病毒通用反转录引物uni12(序列为：5'-AGCAAAAGCAGG-3')进行反转录，反应条件为：70℃10min，37℃90m in。

1.3.3Real-time PCR反应体系的建立及优化以稀释的标准重组质粒为模板，以获得最小Ct值及最高荧光值为指标，采用矩阵法对引物浓度(0.1μM～0.9μM)及探针浓度(0.09μM～0.25μM)进行优化。同时在Taq Man荧光定量RT-PCR反应条件中，选择最佳退火温度(55℃～65℃)对相同浓度的标准重组质粒进行检测。

1.3.4标准曲线建立与结果判定将pMD-HA重组质粒进行10倍梯度稀释至1.92×109copies/μL～19.2copies/μL，在最佳反应条件下同时扩增，绘制标准曲线。荧光强度增加值为阴性对照的2倍～3倍及循环阈值≤0判定为阳性，反之判定为阴性。

1.3.5特异性试验分别选择古典型猪H1N1、类禽型 H1N1、类人 H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2不同谱系猪流感病毒 cDNA，以及PRV、PRRSV核酸为模板进行RF-PCR扩增，检测该方法的特异性。

1.3.6敏感性试验以PBS将108TCID50/m L病毒进行10倍梯度稀释至10-1TCID50/m L，分别提取RNA并反转录cDNA，进行灵敏度检测。

1.3.7重复性试验将同一样品在相同条件下进行5次组内和组间重复试验，测定该方法的重复性。

1.3.8临床样本检测将含量为107TCID50/m L甲型H1N1流感病毒2m L，滴鼻接种40日龄仔猪3头；对照组2头接种等体积生理盐水。感染后每天采集猪鼻拭子样品，置于1m L DMEM中；同时于感染后第3d、第5d和第7d各迫杀一头猪，采集其肺脏和肺脏灌洗液样品，于-80℃冻存，用于病毒检测。对广东、广西、江苏、黑龙江省等猪场分离的疑似甲型H1N1样品44份进行Taq Man荧光定量PCR检测，与最终病毒测序鉴定结果比较，检验该方法的临床检测效果。

2 结 果

2.1 反应体系的优化 对引物和探针的浓度、退火温度进行优化，最佳RT-PCR反应体系为：模板2μL，F/R(10pmol/μL)各 1.8μL、Taq Man 探针(5pmol/μL)1μL、2×Premix Ex Taq 10μL、dH2O 3μL、ROX Reference Dye(50×)0.4μL。RT-PCR 反应条件：95℃15s，55℃ 30s、72℃30s，40个循环。

2.2 标准曲线的绘制 以10倍梯度稀释的阳性重组质粒为模板扩增，得到相应的动力学曲线，其浓度 1.92×109copies/μL～19.2copies/μL 检测的 R2值达到0.999，扩增效率达到104.27%，标准曲线方程为 y=-3.224x+39.715(图 1)。测到50TCID50的病毒(图3)。

2.3 RF-PCR特异性试验 分别选择重组质粒、甲型H1N1流感病毒cDNA为模板，扩增结果为阳性，而古典型猪 H1N1、类禽型 H1N1、类人型H1N1、 H1N2、 H3N2、 H5N1、 H9N2和 以 PRV、PRRSV核酸为模板扩增结果为阴性，表明该方法具有较好的特异性(图2)。

2.4 RF-PCR敏感性试验 将108TCID50病毒进行10倍梯度稀释至10-1TCID50，分别提取RNA并反转录cDNA，进行敏感性试验，结果显示最低可以检

2.5 RF-PCR重复性试验 重复扩增试验Ct值变异系数小于3.12%，表明RF-PCR检测方法重复性好、稳定性高(表1)。

2.6 人工感染及临床样品检测试验 分别于人工感染后1d～7d采集实验猪鼻拭子样品，在3d、5d、7d迫杀取肺脏和肺灌洗液进行检测，结果显示，第3d样品中病毒感染量最高，其结果与TCID50检测结果一致(图4)。RF-PCR检测临床样品结果表明：44份样品中17份鉴定为甲型H1N1阳性样品均出现典型扩增曲线，并且与实验室最终测序鉴定结果相符。

表1 实时荧光定量PCR的组内、组间重复性实验结果(n=5)Table 1Intra-assay and Inter-assay reproducibility test of real-time PCR(n=5)

3 讨 论

甲型H1N1流感病毒造成世界范围的人际传播之后，很快就传播到猪群中。研究表明甲型H1N1流感病毒传染性很强，极易发生基因重排。我国是世界上最大的养猪国家，SIV流行亚型众多，为甲型H1N1流感病毒和其他亚型病毒株进行重组提供了有利条件。由于猪和人的种间屏障相对较低，重组病毒株极易由猪传给人，威胁人类的生命安全。流行病学研究表明，我国猪群中甲型H1N1流感病毒的分离鉴定已经有相关的报道。甲型H1N1流感病毒传播能力很强，因此早期的快速诊断对于疫情的控制至关重要。本研究建立并优化了Real-time PCR检测方法，为甲型H1N1类SIV检测和监测提供快速、灵敏、特异的方法。

甲型H1N1流感病毒的HA基因来源于北美三源重组H1N2流感病毒，二者同源性可达95%以上，这为鉴别诊断方法的建立增加了难度。经过反复序列比较后，在有限的保守区域设计特异性引物和探针，利用Taq Man MGB探针增加溶解温度(Tm)，以此为基础建立的方法能够有效地将甲型H1N1流感病毒的HA基因与其他谱系H1N1SIV区分开。采用正交试验方法对试验体系进行了优化，确定检测敏感度可达到50TCID50。特异性表明，建立的方法可以完全针对我国猪群中流行的主要亚型进行甲型H1N1类流感病毒的鉴别检测。

在44份可疑样品中，有17份结果为RF-PCR试验阳性，与病毒分离和最后测序结果确定甲型H1N1流感病毒阳性样品有高达100%的符合率，但敏感性试验表明检测敏感度可达到50TCID50，这表明该方法不能完全代替病毒分离鉴定方法来做出疾病的最终诊断，但相对于病毒分离鉴定需要1～2个星期，RF-PCR具有快速的特点，仅需要几个小时就能完成，为疾病或疫情的早期诊断提供了重要的检测方法，并且该方法具有快速、简单、识别病毒全基因序列和特点，能够帮助我们更好地了解病毒的重组和病毒生长动力学，在对疾病和疫情的诊断中，RF-PCR和病毒分离鉴定可以互为补充，以达到快速，准确检测的目的。

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