猪巨细胞病毒gB基因的原核表达与间接ELISA检测方法的建立

朱月华，刘 捷，白 娟，宋艳华，王先炜，姜 平

(南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点开放实验室，江苏南京210095)

猪巨细胞病毒(Porcine cytomegalovirus，PCMV)属于疱疹病毒科β病毒亚科，可以引起新生仔猪死亡、鼻炎、肺炎和生长速度减缓。该病毒在世界范围内分布广泛，血清抗体阳性率很高。PCMV抑制宿主的免疫功能和防御机制，尤其是抑制T细胞功能，继发其他病菌感染。此外，猪被认为是异种器官移植的良好供体，PCMV在器官移植中备受关注[1-3]，非人类的灵长类动物受体器官中曾检测到PCMV[4]。因此，建立一种灵敏、快速的PCMV检测方法十分必要。本研究对PCM的糖蛋白B(gB)进行原核表达作为包被抗原，建立了检测PCMV血清抗体的间接ELISA方法，为血清抗体的流行病学检测奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要试验材料 重组质粒pET32a-gB、鼠抗PCMV gB血清、30份PCMV标准阴性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪附红细胞体病(M.suis)、副猪嗜血杆菌病(HPs)血清抗体由本实验室制备保存；PCMV阳性血清由本实验室采用PCMV接种仔猪制备；猪瘟病毒(CSFV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)抗血清来源于IDEXX ELISA试剂盒；蛋白Marker购自Invitrogen公司；ELISA板购自JetBiofil公司；酶标记葡萄球菌A蛋白(HRP-SPA)购自博士德生物工程有限公司；TMB购自南京博全生物工程有限公司。

1.2 重组蛋白的诱导表达与纯化 将已构建的重组质粒pET32a-gB和空质粒分别转化受体菌BL21内诱导表达，表达产物按说明书采用His Bind Kit过柱法纯化，通过western blot对重组蛋白进行鉴定。

1.3 ELISA反应条件的优化

1.3.1抗原包被浓度和待检血清最佳稀释倍数的确定将纯化的PCMV gB蛋白稀释至终浓度0.1μg/m L、0.2μg/m L、0.4μg/m L、0.6μg/m L、0.8μg/m L 和1.0μg/m L，100μL/孔进行包被。一抗设 1∶50、1∶100、1∶200和1∶4004个稀释度做方阵试验确定最佳抗原包被浓度和血清稀释度。

1.3.2包被时间的优化根据确定的包被浓度，分别采用4℃过夜、37℃2h后4℃过夜、37℃2h进行包被，阴、阳性血清按照确定的稀释倍数进行ELISA测定，比较各组阴、阳性血清的OD450nm值和P/N值，选择适合的包被时间。

1.3.3封闭条件的优化根据确定的包被浓度和时间，分别以含5%脱脂乳和含1%BSA的PBST，200μL/孔进行封闭，封闭时间分别为：37℃1h、37℃2h、37℃3h，选择适合的封闭条件。

1.3.4待检血清作用时间的优化酶标板按照选择的条件包被、封闭后，加入阴、阳性血清，37℃分别作用0.5h、1h、1.5h，常规方法检测，选择适合的血清作用时间。

1.3.5酶标抗体工作浓度的优化待检血清按照确定的时间作用后，将酶标抗体分别进行1∶10000、1∶15000、1∶20000稀释，100μL/孔，常规方法检测，选择适合的酶标抗体工作浓度。

1.3.6酶标抗体作用时间的优化将酶标抗体按照确定的稀释倍数加入酶标板后，37℃分别作用0.5h、1h、1.5h，常规方法进行ELISA测定，选择适合的酶标抗体工作浓度。

1.4 临界值的确定 取30份PCMV阴性猪血清，按照已建立的检测方法进行ELISA测定，将得到的数据进行统计学分析，得到OD450nm平均值X和标准差SD。根据统计学原理，OD450nm≥X+3SD时，判为阳性。OD450nm≤X+2SD时，判为阴性，介于二者之间者判为可疑。

1.5 特异性试验 按照建立的检测方法，分别对CSFV、PRRSV、PRV、HPs、PCV2和M.suis阳性血清进行检测，每份血清重复检测两个孔，根据S/P值判定其特异性。

1.6 敏感性试验 选取8份不同的PCMV gB阳性血清和一份阴性血清，在稀释100倍的基础上分别进行倍比稀释，检测所建立方法的敏感性。

1.7 重复性试验

1.7.1批内重复试验采用同一批次制备的抗原包被ELISA板，取5份不同抗体水平的阳性血清和一份标准阴性血清，在同一批试验中进行ELISA测定，每份血清平行做5孔，结果进行统计学分析。

1.7.2批间重复试验采用不同时间制备的3批蛋白包被ELISA板，取5份不同抗体水平的阳性血清和1份阴性血清进行ELISA测定，每份血清平行做2孔，结果进行统计学分析。

1.8 临床血清样品检测 采用本实验建立的间接ELISA方法对2011年～2012年江苏省259份仔猪血清进行检测。

2 结果

2.1 重组蛋白的原核表达、纯化和鉴定 重组菌经IPTG诱导表达重组蛋白gB，纯化后可见一条39ku的目的蛋白条带(图1A)。Western blot鉴定结果显示，该蛋白具有PCVM抗原特性(图1B)。

2.2 间接ELISA工作条件的优化 经过优化确定的最佳抗原包被量为0.4μg/m L；待检血清稀释度1∶100；包被时间为37℃作用2h；然后4℃过夜；5%脱脂乳37℃封闭2h；血清作用时间为1h；二抗1∶10000稀释，37℃作用2h。

2.3 临界值的确定 取30份阴性血清进行检测，结果显示：OD450nm最高值为0.316、最低值为0.073，其平均值为0.177，标准偏差SD为0.0589，因此阳性样品检测下限为+3SD=0.354。为了减少假阳性和假阴性血清出现的概率，将临界值加减一个标准差设为可疑区，即当OD450nm≥0.354时判为阳性；当 OD450nm≤+2SD即 OD450nm≤0.295时判为阴性，介于两者之间判为可疑。

2.4 特异性试验 检测结果显示除PCMV阳性血清检测为阳性外，其他6种猪病毒阳性血清及PCMV阴性血清均为阴性反应，表明该方法特异性较高。

2.5 敏感性试验 采用6份PCMV阳性血清做滴度稀释后进行检测，结果显示，当血清稀释度达到1∶3200时，6份阳性血清的S/P值仍大于0.354，表明该方法敏感性较好(表1)。

2.6 重复性试验 间接ELISA重复性试验结果显示，批内重复性试验的变异系数为2.9%～9.2%，批间重复性试验的变异系数为2.9%～9.9%，均小于10%(表2)，表明该ELISA方法重复性较好。2.7临床血清样品的检测 采用建立的间接ELISA方法对来自江苏省259份送检血清样品进行检测，结果显示这些地区送检血清的PCMV抗体阳性率为21.27%～91.67%，阳性率为57.76%，其中南京和南通地区猪血清抗体检出率为27.27%～36.36%，扬州和沭阳市血清抗体阳性率较高，达70%以上(表3)，表明江苏省猪场PCMV感染比较普遍。

表1 ELISA方法敏感性试验结果Table 1The sensitivity test of the ELISA

表2 间接ELISA批内重复试验和批间重复试验结果Table 2Intra-assay and inter-assay reproducibility test of the indirect ELISA

表3 江苏省不同地区仔猪血清样品间接ELISA检测结果Table 3Result of detecting serum samples of pigs from Jiangsu province by indirect ELISA

3 讨论

PCMV实验室检测方法主要有PCR[5-6]、荧光定量PCR方法[7]、免疫组织化学方法等[8]和ELISA抗体检测方法[3]，其中前3种方法用于检测病毒基因和发病猪组织中病毒抗原。Yoo等报道采用PCMV全病毒为抗原，建立了间接ELISA方法，可以用于检测PCMV抗体[3]。但目前，我国尚无商品化PCMV抗体检测试剂盒可供临床使用。本研究采用重组gB蛋白，经过反应条件的优化，建立PCMV间接ELISA抗体检测方法，具有简单、快速、敏感和特异等优点，可以用于PCMV抗体检测和流行病学研究。

ELISA抗原是建立该方法的关键试剂之一。PCMV基因结构与功能比较复杂，目前已经有报道的病毒基因主要包括DNA聚合酶、核衣壳蛋白和囊膜糖蛋白(gB)等[8-10]，其中，gB蛋白为该病毒复制的必需结构蛋白，具有较好的免疫原性，可以诱导猪体产生中和抗体，具有免疫保护作用[11-12]。因此，本研究选择gB蛋白作为ELISA抗原。为了提高该方法的特异性和敏感性，我们采用本实验室构建的大肠杆菌表达的gB蛋白，经过亲和层析方法纯化获得纯度较高的重组蛋白，包被浓度仅为0.4μg/m L，使用效果较好。

PCMV标准阴、阳性血清是确定该方法判定标准的重要试剂，但由于该标准血清购置存在困难，本项目前期研究采用PCMV人工感染仔猪，制备获得PCMV血清为阳性血清，同时以健康清洁级仔猪制备获得血清作为PCMV阴性血清。在此基础上，我们再采用优化的ELISA反应条件，选择30份PCMV阴性血清，测定OD450nm值，计算平均值X和SD值，OD450nm≥X+3SD为阳性，OD450nm≤X+2SD为阴性，介于两者之间判为可疑，从而确定了该方法PCMV阴阳性血清判定条件。

当然，由于没有商品化试剂盒，该方法与其它抗体检测方法符合率试验尚不能进行。此外，259份临床血清样品检测结果初步表明，江苏省规模猪场PCMV平均抗体阳性率为57.76%，应引起关注。

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