猪圆环病毒2型Cap蛋白与猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白在杆状病毒中共表达及鉴定

王一平，郭龙军，唐青海，刘 丹，危艳武，李胜斌，刘建波，黄立平，吴洪丽，刘长明

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨150001)

猪圆环病毒 2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原，为单股环状DNA病毒，直径为17nm，基因组约1.7kb[1-2]。PCV2含有两个主要的开放阅读框(ORFs)，其中ORF1编码与病毒复制相关的蛋白Rep和Rep'[3]，ORF2编码病毒的结构蛋白Cap[4]。PCV2-Cap蛋白是病毒的主要免疫保护性抗原，能够诱导机体产生特异性免疫应答，是研制基因工程亚单位疫苗的理想靶抗原[5]。口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus，FMDV)是感染偶蹄目动物的重要病原，为单股线状RNA病毒，直径为20nm～25nm，基因组约8.5kb[6-7]。FMDV衣壳蛋白由VP1、VP2、VP3和VP44种结构蛋白各60个分子组成，其中VP1蛋白包含病毒的主要抗原位点，为病毒的主要免疫原性蛋白，能够诱导机体产生中和抗体[8-9]。

研究表明，利用重组蛋白研制的亚单位疫苗对PCV2和FMDV感染具有良好的免疫效果，因此研制同时预防这两种病毒性疫病的二联亚单位疫苗具有重要意义。本研究采用杆状病毒双表达系统，共表达PCV2-Cap和FMDV-VP1蛋白，为进一步研制PCV2与FMDV二联亚单位疫苗奠定基础。

1 材料和方法

1.1 质粒、菌株、细胞和主要试剂 转移载体pFastBacTMDual、转染试剂 CellfectinRⅡReagent、E.coli DH10BacTM感受态细胞和昆虫细胞株(Sf21)均购自Invitrogen公司；Grace's昆虫细胞培养基购自GIBCO公司；高保真酶KOD-Plus-Neo购自TOYOBO公司；辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白(HRP-SPA)购自Zymed公司；DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物科技有限公司；PCV2重组质粒pMD18-PCV2a/CL和O型FMDV-VP1基因重组质粒pMD18-VP1均由本实验室构建并保存；PCV2和FMDV阳性血清由本研究所相关实验室提供。

1.2 引物设计与目的基因扩增 根据pMD18-PCV2a/CL基因序列设计引物，P1-F：5'-ACGCGTCGAC ACCATGGCGTATCCAAGGAGGCGTTTC-3'(SalⅠ)；P1-R：5'-AAAACTGCAGTCAATGGTGATGGTGATG ATGGGGTTTAAGTGGGGGGTCTTT-3'(PstⅠ )。 根据pMD18-VP1基因序列设计引物，P2-F：5'-CCG CTCGAGACCATGGCCACTTCGACAGGCGAGTCG-3'(XhoⅠ)；P2-F：5'-ACATGCATGCTCAATGGTGAT GGTGATGATGTAAGGACTGCTTTACAGGTGCCAC T-3'(SphⅠ)。P1-F和 P2-F中 5'-ACCATGG-3'为“Kozak”序列。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。采用高保真酶扩增PCV2-Cap和FMDV-VP1基因，PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s、62℃30s、68℃45s，35个循环；68℃7m in。

1.3 重组转移载体的构建及鉴定 将PCV2-Cap和FMDV-VP1基因分别克隆至pFastBacTMDual PPH和PP10启动子下游多克隆位点MCSⅠ和MCSⅡ处，构建单表达PCV2-Cap和FMDV-VP1蛋白的重组转移载体pFBD-PCV2-Cap和pFBD-FMDV-VP1。将FMDVVP1基因克隆至pFBD-PCV2-Cap PP10启动子MCSⅡ处，构建共表达PCV2-Cap与FMDV-VP1蛋白的重组转移载体pFBD-Cap-VP1。经PCR、双酶切及测序鉴定。

1.4 重组杆粒的构建及鉴定 将pFBD-PCV2-Cap、pFBD-FMDV-VP1和 pFBD-Cap-VP1分别转化DH10BacTM感受态细胞，在含有X-gal和IPTG的三抗平板(含卡那霉素、庆大霉素和四环素)上进行两轮蓝白菌落筛选，构建重组杆粒rBacmid-PCV2-Cap、rBacm id-FMDV-VP1和 rBacm id-Cap-VP1。 根据操作手册中介绍的方法提取重组杆粒，以M 13通用引物进行PCR鉴定。

1.5 重组杆状病毒的制备 参照转染试剂说明书，将 rBacmid-PCV2-Cap、rBacm id-FMDV-VP1和 rBacm id-Cap-VP1分别转染对数生长期的Sf21细胞，培养至出现细胞病变(CPE)，收获上清，即为P1代重组杆状病毒(rBac-PCV2-Cap、rBac-FMDV-VP1和rBac-Cap-VP1)，传代增殖。

1.6 重组蛋白的表达及鉴定 取P3代重组杆状病毒感染Sf21细胞，27℃培养72h～96h后收获细胞培养物，经SDS-PAGE电泳，薄层扫描测定重组蛋白含量。采用western blot试验检测重组蛋白的反应原性：一抗为 PCV2阳性血清(1∶100)和 /或FMDV 阳性血清(1∶200)，二抗为 HRP-SPA(1∶4000)，DAB显色。

2 结果

2.1 目的基因的PCR扩增 PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCV2-Cap与FMDV-VP1基因分别在预期位置出现特异性片段，表明目的基因扩增正确(图1)。

2.2 重组转移载体的鉴定 pFBD-PCV2-Cap和pFBD-Cap-VP1经PCR扩增获得743bp片段，pFBDFMDV-VP1和pFBD-Cap-VP1经PCR扩增获得685bp片段，分别与PCV2-Cap和FMDV-VP1基因片段大小相符。经双酶切分析，3种重组质粒在预期位置均出现特异性条带，并且测序结果与预期相符，表明这3种重组转移载体构建正确。

2.3 重组杆粒的PCR鉴定 采用M 13正反向通用引物分别对空杆粒和3种重组杆粒进行PCR扩增，空杆粒扩增部位为m ini-attTn7元件，扩增片段大小约为300bp，重组杆粒扩增部位为Tn7R、Tn7L元件和目的基因，rBacm id-PCV2-Cap、rBacm id-FMDVVP1及rBacm id-Cap-VP1扩增片段大小分别约为3300bp、3200bp和4000bp，与预期片段大小(3293bp、3236bp和3969bp)一致，表明这3种重组杆粒构建正确。

2.4 重组蛋白表达的鉴定 SDS-PAGE和western blot检测结果表明，单表达的重组PCV2-Cap蛋白产物在28ku处出现特异性条带，占总蛋白含量的24.6%，可以与PCV2抗体发生特异性反应(图2A、B和C)；单表达的重组FMDV-VP1蛋白产物在30ku处出现特异性条带，占总蛋白含量的5.6%，可以与FMDV抗体产生特异性反应(图2A、B和D)；共表达的重组PCV2-Cap与FMDV-VP1蛋白产物分别在28ku和30ku处出现两条特异性条带，但蛋白表达量有所下降，分别占总蛋白含量的11.6%和3.4%，与PCV2和FMDV抗体均能够发生特异性反应(图2A、B和E)。

3 讨论

本研究选用的杆状病毒双表达转移载体pFast-BacTMDual包含两个启动子，即PPH和PP10启动子，它们均为晚期基因增强型启动子，可以同时高效表达两个外源基因，共表达产物中的两种蛋白均保持各自独立的生物活性[10-11]。为提高PCV2-Cap和FMDV-VP1这2种外源蛋白的表达效率，本实验在设计引物时引入Kozak序列[12]，以期获得高产的共表达产物。本研究中2种外源基因的表达效率存在差异，根据其各自占总蛋白的比例显示，无论单表达或是共表达，PCV2-Cap蛋白的表达效率均显著高于FMDV-VP1蛋白，这与两种蛋白编码基因序列自身性质密切相关，但具体原因有待进一步研究。

PCV2-Cap蛋白是PCV2的主要免疫保护性抗原，能够诱导机体产生中和抗体，为研制PCV2亚单位疫苗的理想靶抗原[5]。FMDV-VP1蛋白是FMDV的主要免疫保护性抗原，能够诱导机体产生中和抗体，为研制FMDV亚单位疫苗的理想靶抗原[9]。目前，防控PCV2和FMDV的感染和传播主要采用灭活疫苗，研究表明，采用重组蛋白亚单位疫苗可以有效预防这2种病毒性疾病，研制同时预防这2种疾病的二联亚单位疫苗具有重要应用价值。本研究采用杆状病毒双表达系统，共表达PCV2-Cap与FMDV-VP1蛋白，并证明共表达产物具有良好的反应原性，已基本满足作为研制亚单位疫苗的条件。下一步工作将利用单表达的重组PCV2-Cap蛋白、FMDV-VP1蛋白，以及两者共表达产物制备几种不同形式的亚单位疫苗，开展猪体免疫攻毒试验，对其免疫原性进行评价，为PCV2与FMDV二联亚单位疫苗的研发奠定基础。

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