甲型H1N1(2009)流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与评价

秦智锋，张彩虹，孙 洁，刘建利，卢体康，阮周曦，林庆燕，吕建强，曹琛福，曾少灵，陈书琨，廖立珊，花群义

(1.深圳出入境检验检疫局，广东深圳518001；2.深圳市检验检疫科学研究院，广东深圳518001；3.深圳市外来有害生物质检测技术研发重点实验室，广东深圳518045)

在甲型流感病毒H1N1(2009)暴发流行期间，许多国家均有人源病毒感染猪的报道[1]。甲型H1N1(2009)病毒在猪体内可以发生变异和重组，进而产生具有潜在危害的新毒株。加强猪群中猪流感病毒(Sw ine influenza virus，SIV)、尤 其是 甲 型 H1N1(2009)流感病毒(Pandemic H1N12009)的检测和监测显得非常迫切。WHO、OIE和FAO联合要求对猪群中甲型H1N1(2009)流感病毒进行监测，并能够与其他病毒株进行鉴别，以评估甲型H1N1(2009)病毒株与其他病毒株重组的风险[1]。

WHO连续推出多个流感参考实验室的常规RT-PCR检测方法和实时荧光RT-PCR检测方法等系列SIV的分子生物学检测标准[2]，包括美国疾病控制中心(CDC)推荐的A型流感病毒、SIV、H1亚型SIV的实时荧光RT-PCR(Real time RT-PCR，rRT-PCR)检测方法。尽管猪流感不是OIE必须呈报的重大动物疫病，OIE也在2009年专门重新制订了SIV检测标准[3]，但其中缺少详细的快速分子生物学检测技术。美国农业部(USDA)也推荐了一种甲型H1N1(2009)[pH1N1(2009)]流感病毒实时荧RT-PCR检测方法[4]。

实际应用表明，美国CDC推荐的rRT-PCR方法存在特异性低的问题。USDA推荐的检测方法具有较高的特异性，但灵敏度较低。因此，本研究在USDA推荐的引物和探针基础上，重新设计了探针和其他改进，建立特异性快速检测甲型H1N1(2009)流感病毒的rRT-PCR方法[rRT-PCR for Pandem ic H1N1(2009)，pH1N1(2009)-rRT-PCR]，并在大量田间样本中进行验证实验。

1 材料和方法

1.1 病毒株 甲型H1N1流感裂解疫苗A/California/7/2009NYMC X-179A购自北京科兴生物制品有限公司；A/Human/shenzhen/0716/2009(H1N1)、A/Human/shenzhen/0804/2009(H1N1)由疾病控制中心惠赠；A/Human/shenzhen/02/2009(H1N1)和 A/Human/shenzhen/03/2009(H1N1)均由深圳儿童医院分离、鉴定；A/Sw ine/huanan/szciq-1/2006(H1N1)和 A/Sw ine/huanan/szciq-2/2006(H3N2)均由深圳出入境检验检疫局实验室分离、鉴定；A/Chicken/HK/HI/1997(H5N1)(禽流感病毒(AIV)H5亚型HI检测抗原)由香港实验室惠赠；AIV H5、H7和H9亚型标准抗原均购自哈尔滨兽医研究所。

1.2 主要试验试剂及仪器 一步法rRT-PCR试剂盒(AgPath-IDTMOne-Step RT-PCR Kit)购自ABI公司；病毒核酸抽提试剂盒(Qiagen Viral RNA Mini Kit)购自Qiagen公司；USDA推荐的甲型H1N1(2009)(pH1N1-2009)流感病毒实时荧光RT-PCR检测引物探针[5]均由上海基康公司合成。

1.3 引物与探针的设计 引物与探针的设计参考USDA推荐的甲型H1N1(2009)(pH1N1(2009))流感病毒rRT-PCR检测的引物和探针。参照Bao等流感序列分析方法[5]，对甲型H1N1(2009)流感病毒序列与GenBank中登录的经典型H1N1SIV、人季节性流感H1N1病毒不同年代、不同国家地区、不同宿主的NA基因进行序列比对分析。以Clustal方式进行比对，以NA基因中最保守的20个寡核苷酸序列作为探针，在探针两侧保守区域设计特异性的上下游引物，并在反转录引物处设计了简并引物，以避免漏检。上游引物FP：5'-CAACACCAACTTTGCTGC-3'，反转录引物RP：5'-GGAACCGATTCTTA(C/T)ACT GTTGTC-3'， 探 针 Pb： 5'-FAM-CAGTCAGTGGTTT CCGTGAAATTAGC-BHQ-3'。

1.4 实时荧光RT-PCR检测方法(rRT-PCR)的建立 参照QIAamp Viral RNA M ini Kit操作说明书，于全自动核酸抽提工作站中抽提A/California/7/2009NYMC X-179A、A/Human/shenzhen/0716/2009(H1N1)、A/Human/shenzhen/0804/2009(H1N1)、 A/Human/shenzhen/02/2009(H1N1)、A/Human/shenzhen/03/2009(H1N1)、 A/Sw ine/huanan/szciq-1/2006(H1N1)、A/Sw ine/huanan/szciq-2/2006(H3N2)、A/Chicken/HK/HI/1997(H5N1)和AIV H5、H7和H9亚型标准HI检测抗原等11株流感病毒的与阴性对照鸡胚尿囊液中的核酸。

参照AgPath-IDTMOne-Step RT-PCR Kit操作说明书配制荧光RT-PCR反应体系：2×RT-PCR 12.5μL、酶混合物1μL、10μM 的pH1N1(2009)-FP 1μL和pH1N1(2009)-RP各 1μL、5μM pH1N1(2009)-Pb 1μL、无核酸酶的水2.5μL、RNA模板5μL。

PCR反应程序为：45℃30m in；95℃10m in；95℃ 10s、60℃ 30s，40个循环；设置60℃ 时收集荧光信号。

1.55 种实时荧光RT-PCR检测方法灵敏度比较选取A/California/7/2009NYMC X-179A裂解疫苗株作为灵敏度的研究对象，该病毒株的HA滴度为1∶640，鸡胚半数致死量为108.5EID50/m L。以无核酸酶的水10倍系列稀释成1×10-1～1×10-10，采用EZ1抽提核酸。按照WHO推荐美国CDC建立的检测方法和美国农业部推荐的检测方法，与本研究建立的pH1N1(2009)-rRT-PCR方法进行灵敏度检测比较，确定所建立方法的灵敏度。

1.65 种实时荧光RT-PCR检测方法特异性比较采用建立pH1N1(2009)-rRT-PCR方法对11株流感病毒株进行检测，确定本研究建立的检测方法与经典型SIV H1N1及其他亚型之间的交叉反应。采用本研究建立的方法对实验室保存的鸡肉正常组织、鸡血清、火鸡肌肉组织、鸽组织、猪肉组织、猪血清、正常鸡胚尿囊液、其他家禽病毒和细菌共16份非流感毒株样品进行检测，进一步确定所建立方法的特异性。

采用抽提的核酸，同时评估WHO推荐的美国CDC建立的 CDC-InfA-rRT-PCR、CDC-SW-InfA-rRT-PCR、CDC-SW-H1-rRT-PCR和 USDA-pH1N1(2009)-rRT-PCR检测方法的特异性。

1.7 pH1N1(2009)-rRT-PCR重复性试验 将建立的pH1N1(2009)-rRT-PCR方法组装成试剂盒，测定其稳定性。对A/California/7/2009NYMC X-179A裂解疫苗株原液进行10-4、10-5和10-6稀释后，分别抽提核酸，进行3次重复检测，确定所建立方法的组内差异。将3个梯度抽提的核酸，分别用保存1周、1个月和3个月的试剂盒进行检测，确定组间差异。

1.8 深港实验室之间的比对 为了进一步确证所建立pH1N1(2009)-rRT-PCR检测方法的准确性和可靠性，将A/Human/shenzhen/0716/2009(H1N1)、A/Sw ine/huanan/szciq-1/2006(H1N1)、A/Sw ine/huanan/szciq-2/2006(H3N2)株和本研究建立方法的相关试剂，在香港与兽医化验所进行检测方法比较。其中香港提供了3株病毒(2株为经典型猪流感H1N1、1株为香港分离的甲型H1N1流感病毒株)。

1.9 田间试验 自2009年5月份开始，从大型猪场和养禽场采集样品进行甲型H1N1流感病毒的监测。按照CDC-InfA-rRT-PCR方法进行流感病毒的筛选检测，如果检出阳性样品，再按CDC-SW-H1-rRT-PCR和pH1N1(2009)-rRT-PCR方法进行检测。

2 结果

2.1 rRT-PCR的建立 以设定的反应条件，于荧光PCR仪上进行pH1N1(2009)-rRT-PCR检测。在阴性对照成立的情况下，5株甲型H1N1(2009)流感病毒株出现特异性实时扩增，AIV和SIV均没出现特异性扩增，相互之间无相关交叉反应(图1)。

2.25 种实时荧光RT-PCR检测方法灵敏度试验结果 将10倍系列稀释的A/California/7/2009NYMCX-179A的RNA同时进行CDC-InfA-rRT-PCR、CDC-SW-InfA-rRT-PCR、CDC-SW-H1-rRT-PCR、USDA-pH1N1(2009)-rRT-PCR和pH1N1(2009)-rRT-PCR灵敏度测定。结果显示，所建立的pH1N1(2009)-rRT-PCR检测方法的灵敏度为 10-6，即4.51EID50(图 2)。 CDC-InfA-rRT-PCR(图 3)、 CDC-SW-InfA-rRT-PCR(图略)和 CDC-SW-H1-rRT-PCR(图略)的灵敏度为10-6，即4.51EID50。美国农业部推荐的USDA-pH1N1(2009)-rRT-PCR检测方法的灵敏度为10-5， 即 45.1EID50(图 4)。pH1N1(2009)灵 敏 度 与CDC-InfA-rRT-PCR的灵敏度相当，比USDA-pH1N1(2009)-rRT-PCR灵敏度高10倍，并且荧光增幅也较高。所建立的pH1N1(2009)-rRT-PCR检测方法检测5株甲型H1N1(2009)流感病毒的灵敏度为100%(5/5)，无漏检现象。

2.35 种实时荧光RT-PCR检测方法特异性试验结果 对11株流感病毒株进行特异性检测，5株甲型H1N1(2009)流感病毒株结果为阳性，其他6株非甲型H1N1(2009)流感病毒株均无扩增结果。表明本研究建立的方法特异性强，在流感病毒亚型之间无交叉反应(图1)。通过对16份非流感病毒株阳性样品的检测，结果均为阴性(图略)，表明本研究建立的pH1N1(2009)-rRT-PCR检测方法的特异性为100%(27/27)。表明该方法特异性强，与其他检测对象无交叉反应。

针对所有亚型的流感病毒，通用型检测方法CDC-InfA-rRT-PCR特异性较好，能够全部扩增出11株流感病毒株，与其他非流感病毒株的16份核酸样品无交叉。CDC-SW-InfA-rRT-PCR主要是用来检测SIV，但试验表明，该方法不但可以检测出SIV A/Sw ine/huanan/szciq-1/2006(H1N1)，而且能够检测出 AIV A/Chicken/HK/HI/1997(H5N1)和 AIV H5、H7和H9亚型标准抗原，但却不能检测出SIV A/Sw ine/huanan/szciq-2/2006(H3N2)。CDC-SW-H1-rRT-PCR可以特异性检测所有经典型的H1N1流感和甲型H1N1(2009)流感病毒，但不能将两者区分开来。USDA-pH1N1(2009)-rRT-PCR特异性较差，在检测A/Chicken/HK/HI/1997(H5N1)株时有微弱的扩增信号(图 5)。

2.4 重复性试验结果 采用本研究组装的pH1N1(2009)-rRT-PCR检测试剂盒测定A/California/7/2009NYMC X-179A裂解疫苗株10-4、10-5和10-63个稀释度的组内变异系数CV≤0.45%，符合检测试剂盒的要求。不同时期组装的试剂盒测定3个稀释度后的组间差异系数为1.89%～3.72%，初步将检测试剂盒的有效期定为6个月(表1)。

表1 pH1N1(2009)-rRT-PCR检测试剂盒的组内和组间重复性实验结果Table 1Intra-assay and inter-assay reproducibility test of the pH1N1(2009)-rRT-PCR kit

2.5 深港实验室之间的比较 本研究建立的pH1N1(2009)-rRT-PCR检测方法与香港实验室同时进行6株流感病毒株的检测，可以特异性地检测出两株甲型H1N1(2009)流感病毒株。检测香港甲型H1N1(2009)分离株的灵敏度为10-6。所建立的方法与香港采用的方法特异性和灵敏度一致，但扩增效率明显高于香港方法(图略)。

2.6 田间试验 采集2009年～2011年注册猪场和注册禽场近3800份混合棉拭子样品进行3种rRT-PCR检测。其中CDC-InfA-rRT-PCR和CDCSW-H1-rRT-PCR两种方法共筛选出23例阳性样本，但经pH1N1(2009)-rRT-PCR检测全部为阴性。挑选其中8例样本送至国家参考实验室进行亚型确定，检测结果全部为经典型猪流感H1N1，而未检测到甲型H1N1(2009)流感病毒。pH1N1(2009)-rRT-PCR检测方法与国家参考实验室检测结果一致。

3 讨论

甲型H1N1(2009)流感病毒在许多洲的猪群中均有检出，同时也进行了人工感染和传播试验[1]。目前没有证据表明猪在甲型H1N1(2009)流感病毒的流行病学中具有重要的作用。但香港已经发现甲型H1N1(2009)流感病毒已经开始与一些经典型的H1N1流感病毒和其他亚型发生重组，可能导致新的高传播性病毒株出现。因此，对猪群中的甲型H1N1(2009)流感病毒进行流行病学调查和普查监测尤为迫切。鉴于SIV的危害性，WHO、FAO和OIE均加大了对SIV的检测和监测。世界各国对动物及动物进出口产品贸易中甲型H1N1(2009)流感病毒实施严格的控制和检疫。

实时荧光PCR由于具有灵敏、准确、快速的特点而被国内外广泛应用于临床诊断[6-7]。WHO在2009年4月甲型H1N1(2009)流感病毒株暴发流行期间，将CDC所建立的甲型H1N1(2009)流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法作为国际标准。但本研究在对WHO推荐的方法进行评估过程中表明，这些检测方法的特异性存在问题，不能对甲型H1N1(2009)流感病毒和经典型SIV H1N1病毒进行区分。美国CDC建立的特异性检测SIV的CDC-SW-InfA-rRT-PCR检测方法，在检测H1N1亚型SIV和AIV样品时也表现出阳性结果，并且对于A/Swine/huanan/szciq-2/2006(H3N2)非H1N1亚型病毒株出现漏检。美国农业部推荐的USDA-pH1N1(2009)-rRTPCR检测方法可以区分经典型SIV H1N1和甲型H1N1(2009)流感病毒，但检测灵敏度较低(10-5)，并且对检测A/Chicken/HK/HI/1997(H5N1)株有微弱非特异性反应。Blast分析表明，其探针位点有4个碱基缺失。根据理论推算，探针中每一个碱基的错配可导致降低约一个Ct值[8]。另外其上游引物也出现了一个碱基的错配和一个碱基的缺失。本研究在美国农业部推荐的引物和探针基础上，重新设计了探针，确保100%相符率，并且在反转录引物处设计了简并引物，以避免漏检[9-10]。在扩增反应中提高了退火温度，以确保检测方法的特异性[11]。

本研究建立的pH1N1(2009)-rRT-PCR检测方法对检测甲型H1N1流感裂解疫苗的灵敏度可以达到10-6，与WHO推荐的A型流感病毒实时荧光PCR检测方法的灵敏度相同，而高于美国农业部推荐方法的检测灵敏度(10-5)。pH1N1(2009)-rRT-PCR检测方法与经典型H1N1和其他亚型流感病毒株无任何交叉反应，可以有效区分经典型SIV H1N1和甲型H1N1(2009)流感病毒，保证了检测的特异性。与香港兽医化验所进行了检测比较，检测灵敏度和特异性完全一致。田间试验对3800份猪和禽类样品进行检测，CDC-InfA-rRT-PCR和CDC-SW-H1-rRTPCR方法检测到的23份阳性样品，经pH1N1(2009)-rRT-PCR检测均为阴性。抽样送国家参考实验室进行检测，结果也均为阴性，证实了pH1N1(2009)-rRT-PCR检测方法的在田间试验中具有较高的特异性。本研究建立的检测方法灵敏度高、特异性好，适合于甲型H1N1流感病毒的分子生物学检测和田间样品的大规模普查监测。

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