SPF雏鸡感染REV后IL-2m RNA表达的动态变化

李恩扩，陈雪锋，孔 斌，胡敬东

(山东农业大学动物医学院，山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室，山东泰安271018)

白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)，主要是由活化的T淋巴细胞产生的一类细胞因子，在机体的免疫调节中具有重要作用，其分泌水平的高低可以反映机体的细胞免疫功能状态[1-2]。

禽网状内皮增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)是一种可以造成感染鸡只严重免疫抑制后果的肿瘤病毒[3]，本实验通过荧光定量PCR检测REV感染鸡免疫器官中IL-2mRNA的表达水平，可以对免疫器官中T细胞的活化程度进行初步评价，以研究IL-2在REV致病中的作用。

1 材料和方法

1.1 病毒株及实验动物 REV由山东农业大学动物医学院孙淑红提供；1日龄SPF鸡购自山东济南SAIS家禽科技有限公司(许可证号 SCXK[鲁]20090003)。

1.2 主要试剂 SYBR Green荧光定量PCR试剂盒和DNA Marker DL2000购自宝生物工程(大连)有限公司；TransZol Up和反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 引物合成 根据GenBank中登录的鸡IL-2(ChIL-2)基因(AJ224516.1)和内参核糖体蛋白亚基4(RPL4)基因序列(AJ720803.1)，应用 DNAStar软件设计两对特异性引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。ChIL-2引物为，P1：5'-TCTTTGG CTGTATTTCGG-3'， P2： 5'-CTGGGTCTCAGTTGGT GT-3'，预期扩增片段为270bp；RPL4引物为，P3：5'-TCTGCATTTGGACTGAAAGC-3'， P4： 5'-TTCTG GATCTCCTGGCTTCT-3'，预期扩增片段为154bp。

1.4 RNA的提取及cDNA的合成 鸡的3种免疫器官细胞总RNA提取按照TransZol Up说明书进行，反转录按照TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperM ix说明书进行，cDNA合成反应体系为20μL：总 RNA 1μg，0.5μg/μL Oligo(dT)181μL，10μL 2×TS Reaction M ix，1μL TransScript RT/RI Enzyme M ix，其余加RNase-free水补足，混匀后于42℃孵育30m in，85℃反应5min，cDNA于-20℃保存备用。

1.5 IL-2和RPL4基因片段的扩增与鉴定 采用20μL体系进行PCR扩增，各取上步反应得到的cDNA 6μL，分别加入 10μmol/L P1和 P2、P3和P4引物 2μL，25mmol/L dNTP 2μL，10μL 2×PCR ReactionM ix进行PCR扩增。反应条件为：94℃5m in；94℃ 30s、58.5℃ 45s(ChIL-2)/60℃ 30s(RPL4)、72℃ 30s，30个循环； 72℃10m in。扩增产物于2%琼脂糖凝胶中电泳检测。经胶回收，与pMD18-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，挑选单菌落后扩大培养提取重组质粒，经PCR初步鉴定正确后，阳性重组质粒由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，按文献[4]方法计算重组质粒的拷贝数。将构建的重组质粒pMD-chIL-2和pMDRPL4作为本研究的阳性标准品。

1.6 IL-2SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立 反应总体积为20μL，其中SYBR Premix Ex TaqTM(200×)10.0μL，ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4μL，上、下游引物(10μmol/L)各 0.3μL，质粒模板2.0μL，灭菌蒸馏水7.0μL。反应程序为：95℃15s；95℃ 5s，60℃ 34s，40个循环。为了分析SYBR Green IPCR扩增特异性，对扩增产物制作熔解曲线，条件为：95℃15s，60℃1m in，95℃15s，60℃15s。反应设内参RPL4基因和空白对照。并利用相应软件进行分析，建立标准曲线和熔解曲线[5]。

1.7 动物试验 120只1日龄SPF鸡随机分为两组：REV处理组和正常对照组(处理组每只腹腔注射102TCID50REV，对照组注射生理盐水)，每组60只，相同方式饲养，每组分别于7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d随机取6只迫杀，立即取脾脏、胸腺和法氏囊并置于-80℃，备用。

1.8 实时荧光定量PCR检测不同时期IL-2基因m RNA的转录水平 以纯化的cDNA为模板，内参RPL4为对照，每一时期取6个样品，每个样品重复两次，用建立的最优方法进行检测。

1.9 数据处理与分析 根据比较阈值法[4]计算出目的基因的相对含量，目的基因的相对含量=2-△△Ct。注释：△△Ct=[CtT-CtHK]X-[CtT-CtHK]0，T=待测基因；HK=内参基因；X=待测样本；0=校正样本。数据采用SPSS17.0统计软件，两组试验结果采用t检验法进行分析。

2 结果

2.1 IL-2和内参RPL4基因片段的PCR扩增及重组质粒的鉴定 以鸡免疫器官细胞提取的总RNA为模板，通过特异性引物扩增chIL-2和RPL4基因片段，经3%琼脂糖凝胶电泳结果显示，其扩增片段分别约为270bp和154bp(图1)，与预期大小相符。对构建的重组质粒pMD-chIL-2和pMD-RPL4进行测序鉴定，结果两基因片段均与GenBank中登录的序列完全一致。

2.2 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR熔解曲线和标准曲线的建立 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR熔解曲线分析表明，该方法扩增的目的基因(IL-2)和内参基因(RPL4)均具有特异性，只出现各自的单一峰(图2)，无引物二聚体或其他非特异性产物生成。

该方法具有较高的灵敏度，IL-2的检测下限为100copies/μL，建立的标准曲线斜率分别为-3.0406(IL-2)和-3.1504(RPL4)，两基因的扩增效率均在107%左右，其相关系数也均在0.99以上(图3、图4)，符合比较阈值法相对定量分析的前提，检测所得Ct值可以按比较阈值法分析[4]。

2.3 IL-2基因荧光定量的表达水平 本实验将对照组7d时IL-2基因的表达量作为参照因子，处理组及其他时期IL-2基因的表达量与其相比，得到相应基因表达量的倍数，采用内参RPL4对IL-2基因进行均一化处理，SPF鸡免疫器官IL-2基因的相对表达情况见图5～图7。

图5～图7表明，处理组与对照组相比，除21d、28d脾脏IL-2基因表达量升高但不显著以外(p>0.05)，其他均表现显著升高(p<0.05)。

3 讨 论

IL-2主要由激活的Th1淋巴细胞产生并分泌，它通过与IL-2受体(IL-2R)结合产生以下作用：(1)刺激T淋巴细胞增殖；(2)激活T淋巴细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞等效应细胞产生杀灭肿瘤细胞作用；(3)刺激T淋巴细胞产生IL-2、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)等免疫增强因子，间接增强B淋巴细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞等效应细胞产生杀灭肿瘤细胞作用[6]；(4)通过刺激产生TNF使肿瘤细胞凋亡，在机体免疫中处于中心地位。许多实验证明，ChIL-2与哺乳动物的IL-2生物活性相似，作为一种免疫调节分子在鸡的免疫系统中起重要作用[7]。利用IL-2活性检测来反映淋巴细胞功能，特别是T细胞的功能，日趋用于免疫功能的研究[8]。

Xu等研究表明，m iR-26a作为一种肿瘤抑制物，在REV转化形成的多种淋巴瘤细胞系中下调表达，可以引起其靶基因ChIL-2的过表达，继而刺激瘤细胞的增殖[9]。这一发现支持了我们的结果，即REV感染可以导致IL-2基因的转录水平显著升高。IL-2能够刺激产生TNF[6]，而且已有学者报道，REV感染会引起脾细胞肿瘤坏死因子(TNF)水平明显增高，这种过高水平的TNF对免疫器官具有免疫损伤作用，与免疫功能的下降密切相关[10]。但Hrdlickova等研究认为，REV-T株感染转化的瘤变细胞膜上IL-2R结合性地降低IL-2的水平，使IL-2大大减少，造成严重的免疫功能障碍[11]。国内李广兴等的研究结果显示SPF雏鸡感染REV后造成胸腺和脾脏T淋巴细胞IL-2诱生活性明显降低[12]。

脾脏、法氏囊和胸腺是禽类的主要免疫器官，本研究采用实时荧光定量PCR对REV感染鸡上述器官的IL-2表达量进行了检测，结果表明，除了试验组21日龄、28日龄鸡的脾脏IL-2基因转录水平升高但不明显外(p>0.05)，其他处理组与正常对照组相比均存在显著差异(p<0.05)。

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