鸭坦布苏病毒NS1基因的克隆及原核表达

郭建伟，董嘉文，孙敏华，李林林，袁建峰，吴玄光，胡奇林*

(1.华南农业大学兽医学院，广东广州510642；2.广东省农业科学院兽医研究所广东省兽医公共卫生公共实验室，广东广州510640)

鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus，DTMUV)属于黄病毒科黄病毒属的坦布苏病毒，是DTMUV病的病原[1-3]。DTMUV病于2010年在华东地区首次发生，已蔓延至全国各地的养禽场。该病毒能够感染鸭、鹅和鸡[4-5]，蛋鸭发病后，临床上以病鸭厌食、排稀便、产蛋量急剧下降甚至停止，卵泡出血，变性，坏死为主要特征，其发病率高达100%，死亡率为5%～10%[1-2]，开展该病深入的流行病学研究具有重要的经济和公共卫生意义。目前，适用于该病大规模血清流行病学研究的方法只有用纯化的全病毒抗原建立的间接ELISA方法[6]，但由于该方法采用全病毒抗原，具有潜在散毒的危险，同时成本高。因此，迫切需要建立一种更加安全、成本低廉的流行病学监测方法。

DTMUV的基因组为不分节段的具有感染性的单股正链RNA，长度为10990个核苷酸，顺序为5'-UTR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-N S5-UTR-3'。DTMUV非结构蛋白NS1由404个氨基酸组成[7]，具有保守性和抗原性。迄今为止，未见DTMUV NS1克隆表达的报道。本研究将DTMUV NS1基因克隆到pET32a(+)载体，在Rosetta中表达，获得重组表达的DTMUV NS1，为DTMUV病的诊断和血清流行病学监测方法的建立奠定基础。

1 材料和方法

1.1 病毒和菌株 DTMUV JM株及其抗血清，为广东省农业科学院兽医研究所禽病研究室分离鉴定、制备和保存；阳性血清是采自本实验室用DTMUV分离株感染DTMUV阴性鸭耐过后28d的血清。

1.2 主要试剂及质粒 RNA抽提试剂盒、Bam HⅠ、Hin dⅢ、T4DNA连接酶、DNA Marker、pMD18-T Simple购自宝生物工程(大连)有限公司；M-MLV反转录酶购自Invitrogen公司；DNA胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；预染蛋白质Marker购自Fermentas公司；兔抗鸭IgG购自Nordic公司；OPD购自北京鼎国生物技术有限责任公司；大肠杆菌工程菌株DH5α、Rosetta、pET32a(+)为本实验室保存。

1.3 引物设计与合成 根据GenBank中DTMUV NS1基因序列(JF312912)设计引物，预计扩增片段大小为1065bp，引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。上游引物：5'-TATGGATCCGACACG GGGTGCTCAA-3'(Bam HⅠ)；下游引物：5'-CCC AAGCTTAGCCATGACCTTT GATTT-3'(Hin d Ⅲ)。

1.4 DTMUV NS1基因的扩增 参照RNA抽提试剂盒操作说明提取DTMUV RNA，反转录合成cDNA。以cDNA为模板进行RT-PCR扩增。反应条件为：94℃ 5min；94℃ 30s、53℃ 30s、72℃ 1min，30个循环；72℃ 10m in。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 NS1扩增产物的克隆与测序 将扩增的NS1基因与pMD18-T-simple载体连接，转化至E.coli DH5α感受态细胞，提取重组质粒进行Bam HⅠ、Hin dⅢ双酶切及PCR鉴定，由上海英潍捷基生物技术有限公司测序并将重组质粒命名为pMD18TNS1。

1.6 重组表达载体的构建 将pMD18T-NS1经Bam HⅠ、Hin dⅢ双酶切后的目的片段与经同样酶切的pET32a(+)载体连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，提取重组质粒进行双酶切及PCR鉴定，由上海英潍捷基生物技术有限公司测序，并命名为pET32a-NS1。

1.7 重组菌的诱导表达及蛋白可溶性分析 将pET32a-NS1转化Rosetta感受态细胞，37℃培养至OD600nm达0.5～0.8，加IPTG至终浓度为1.0mmol/L，37℃诱导3h，进行SDS-PAGE分析。用超声仪破碎菌体，分离上清和沉淀，分别进行12%SDSPAGE分析表达蛋白的可溶性。

1.8 重组蛋白的提取及纯化 将诱导表达的重组菌用超声波裂解，离心，弃去上清，加15m L Binding Buffer重悬菌体，冰浴2h，4℃ 11000r/min离心20m in，收集上清，得溶解的包涵体。按Novagen公司的Ni-NTA His.Bind树脂说明书对重组蛋白进行纯化，进行浓缩，bradford方法测定蛋白浓度。

1.9 Western blot检测 表达的NS1重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，电转印至NC膜。以1∶50倍稀释的DTMUV阳性血清为一抗，1∶5000HRP标记的羊抗鸭IgG为二抗，用DAB显色。

2 结果与讨论

2.1 DTMUV NS1基因RT-PCR PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测显示，获得了一条约1100bp的特异性片段，与预期大小(1065bp)一致(图1)。

2.2 pET32a-NS1的鉴定 pET32a-NS1经酶切鉴定，与预期结果一致。并将测序结果与标准株进行比较，结果显示扩增的目的片段与参考基因的核苷酸序列同源性为99%。

2.3 阳性重组菌的诱导表达及蛋白可溶性分析

pET32a-NS1经IPTG诱导表达，将表达重组蛋白进行SDS-PAGE分析，结果表明，在约59ku出现一条特异性蛋白条带，与预期的蛋白分子量大小一致(图2)。诱导表达的重组菌经超声裂解后，分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE，结果表明表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在。

2.4 NS1重组蛋白western blot检测 用DTMUV阳性血清对该重组蛋白进行western blot检测，结果显示，在约59ku处有一条特异条带，表明NS1重组蛋白能够与DTMUV阳性血清特异性结合，证明该蛋白具有良好的反应原性(图3)。

NS1是DTMUV的非结构蛋白，其功能尚不清楚。而黄病毒科登革病毒(DENV)的NSl是DENV非结构蛋白中唯一的糖蛋白，是唯一能够在感染细胞表面表达和分泌到胞外的非结构蛋白，高度保守，含有群特异性和型特异性决定簇，具有多种T和B细胞抗原表位，能够诱发细胞免疫和体液免疫应答，检测血清中NS1水平可以用于DENV感染的早期诊断和分型诊断[8]。针对非结构蛋白的抗体只在病毒感染的宿主中存在，而在经灭活疫苗免疫的动物体内检测不到，从而可以区别感染动物和免疫动物[9]。因此，开展DTMUV NS1的表达研究，将为建立能够区别DTMUV感染的动物和灭活疫苗免疫动物的检测方法奠定基础，对该病的防控及净化具有重要意义。

本研究为研制能够区分感染动物和免疫动物的安全、成本低廉的血清学检测方法和试剂奠定了基础，对该病的有效防制具有重要意义。

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