超声辅助提取兖州卷柏生物碱及其对H22肝癌细胞增殖抑制影响

邱丹缨，温扬敏，谢永华，苏 齐，余琼琼，林文东

（1.泉州医学高等专科学校，福建泉州362011；2.福建省泉州市医药研究所，福建泉州362000）

兖州卷柏（Selaginella involvens，Spring）为卷柏科植物兖州卷柏的全草，是多年生草本植物[1]。兖州卷柏具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、镇痛、降血糖、增强人体免疫功能等作用[2-3]。生物碱是最古老的药物之一，也是现今药物的最主要来源之一。近年来，国内外对各种生物碱的研究利用愈来愈深入。本文研究超声波辅助乙醇法对兖州卷柏生物碱提取，设计正交实验优选出超声波提取兖州卷柏生物碱的最佳条件，为兖州卷柏的进一步开发利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

兖州卷柏 采自福建宁化县治平乡泥坑村，由泉州市医药研究所苏齐主任医师鉴定；盐酸小檗碱标准品 购自上海源叶生物科技有限公司；小鼠H22肝癌细胞株 购自天呈科技生物公司；DMSO，MTT，RPMI1640培养基，小牛血清 购自赛默飞世尔科技公司（北京）；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自碧云天生物公司；注射用环磷酰胺（CTX） 购自山西普德药业有限公司（国药准字H14023686）；氯仿 AR，天津市化学试剂一厂；无水乙醇 西陇化工股份公司；溴甲酚绿指示剂 称取0.02g溴甲酚绿溶于1.43mL的0.02mol/L的NaOH溶液，双蒸水稀释至50mL；乙酸乙酸纳缓冲液（pH=4.0） 称取8.2g无水乙酸钠，加23mL冰醋酸并稀释至250mL。

SP-752型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；VGT-1620QTD型超声波清洗机 深圳市兴宏业投资有限公司；RE5210型旋转蒸发器 上海予腾生物科技有限公司；KHBST-360型酶标仪 上海科华；HF-90型CO2培养箱 北京阳光思特生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 生物碱提取工艺研究

1.2.1.1 不同乙醇浓度对兖州卷柏生物碱提取的影响 取兖州卷柏全草除杂，水洗后晒干。放入粉碎机粉碎3min成粉末。称取5g兖州卷柏粉末，放入500mL锥形瓶，再加入60%、70%、80%、90%和100%乙醇150mL于室温浸泡24h。用功率30W，频率34Hz超声波处理40min后过滤，取上清液烘箱烘干。将烘干后的粉末，加入2%HCl溶液100mL浸泡12h后过滤，用氨水溶液调至pH=10。取上清液用于测定生物碱含量。另外，取分液漏斗依次加入上清液和氯仿萃取，反复萃取至无生物碱反应为止，减压蒸馏，回收氯仿得到生物碱粉末[4]。

1.2.1.2 不同固液比对兖州卷柏生物碱提取的影响称取5g兖州卷柏粉末，放入500mL锥形瓶，再加入固液比（g/mL）为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的70%乙醇于室温浸泡24h。在功率30W，频率34Hz超声波处理40min后过滤，取上清液烘箱烘干。将烘干后的粉末，加入2%HCl溶液100mL浸泡12h后过滤，用氨水溶液调至pH=10。取上清液5mL用于测定生物碱含量。

1.2.1.3 正交实验对兖州卷柏生物碱提取的影响 在预实验的基础上设计三因素三水平正交实验，因素水平见表1。生物碱提取方法同1.2.1.1。

表1 提取生物碱的实验因素水平表Table 1 Factors and levels of alkaloid extraction

1.2.2 生物碱含量测定

1.2.2.1 标准曲线测定 精确配制浓度为0.40、0.20、0.10、0.05、0.025mg/mL的盐酸小蘖碱标准溶液。分别取不同浓度的盐酸小蘖碱标准溶液1mL置于分液漏斗中，接着加入2.5mL乙酸钠缓冲液，再加入2.0mL溴甲酚绿指示液，振荡5min，静置分层20min。另外，取1mL双蒸水，用同样方法制备空白对照组。取氯仿层，以空白对照组调零，在415nm处测定吸光度[5]。以盐酸小蘖碱浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到标准曲线y=4.865x+0.140（R2=0.996）。

1.2.2.2 样品生物碱含量测定 取兖州卷柏提取液1mL，置于分液漏斗中，接着加入2.5mL乙酸钠缓冲液，再加入2.0mL溴甲酚绿指示液，振荡5min，静置分层20min。另外，取1mL双蒸水，用同样方法制备空白对照组。取氯仿层，以空白对照组调零，在415nm处测定吸光度。按标准曲线计算生物碱含量。

生物碱提取率（%）=生物碱质量/兖州卷柏粉末质量×100 式（1）

1.2.3 生物碱对肝癌细胞H22增殖抑制作用 采用MTT法[6]测定生物碱对H22肝细胞增殖抑制作用。H22肝癌细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，在5%CO2、37℃饱和湿度条件下培养。收集对数生长期细胞，分于96孔板，调整细胞浓度约6000个细胞每孔。每孔分别加入含生物碱0（空白对照组）、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mg/mL的培养液中培养，另设一组含2mg/mL环磷酰胺（CTX）作为阳性对照。细胞分别培养12、24、48h。按MTT试剂盒说明书测定细胞抑制率。

抑制率（%）=（1-实验组吸光度/空白对照度吸光度）×100 式（2）

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度对兖州卷柏生物碱提取的影响

不同乙醇浓度对兖州卷柏生物碱提取的影响见图1。从图1可以看出，乙醇浓度小于70%时，生物碱提取率随乙醇浓度增加而增多。而乙醇浓度大于70%以上，生物碱提取率随乙醇浓度增加而减少。当乙醇浓度为70%时，兖州卷柏生物碱提取率最多，达1.08%。

图1 乙醇浓度对生物碱提取率的影响Fig.1 Effect of different concentration of ethanol on extracting rate of alkaloids

2.2 固液比对兖州卷柏生物碱提取的影响

固液比对兖州卷柏生物碱提取的影响见图2。从图2可以看出，当固液比小于1∶40g/mL时，随着固液比增加兖州卷柏生物碱提取率迅速增高。但当固液比大于1∶40g/mL时，继续增加乙醇量，兖州卷柏生物碱提取率趋于稳定。其原因可能是增加乙醇量有利于生物碱的溶解。但当加乙醇量达到一定程度时，生物碱已全部溶解，所以继续增加乙醇量生物碱提取率不再增加。考虑到固液比大，会给后续工序带来困难，消耗较多热能等，综合各方面考虑，适宜的固液比为1∶40g/mL。

图2 固液比对生物碱提取率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extracting rate of alkaloid

2.3 正交实验优化生物碱提取工艺

表2 生物碱提取的正交实验Table 2 Orthogonal experiment of extracting alkaloid

表3 物碱提取的正交实验方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment of extracting alkaloid

通过预实验选择设计三因素三水平正交实验，研究超声波对生物碱提取的最佳条件。其结果见表2。从表2可以看出影响生物碱提取的首要因素是超声功率，其次是超声时间和超声温度（B＞A＞C）。根据方差分析（见表3），超声功率和时间对生物碱提取影响显著（p＜0.05），而超声温度对生物碱提取有一定影响，但影响不显著（0.05＜p＜0.10）。生物碱提取最佳工艺是超声时间60min、超声功率400W、超声温度60℃（A3B2C2）。验证实验表明，此时提取率达1.18%。

2.4 生物碱对H22肝癌细胞增殖抑制作用

兖州卷柏生物碱对H22肝癌细胞体外增殖抑制作用见图3，从图3可以看出细胞培养12h后，实验组对H22肝癌细胞的抑制率均低于对照组（CTX组），但所有实验组与对照组之间均无显著差异（p＞0.05）。细胞培养24h后，SIA4和SIA5对肝癌细胞抑制率高于对照组，且SIA5与对照组之间存在显著差异（p＜0.05）。细胞培养48h后，SIA3、SIA4和SIA5对肝癌细胞抑制率高于对照组，其中SIA4和SIA5与对照组之间存在显著差异（p＜0.05）。其中SIA5生物碱浓度为8mg/mL时，对肝癌细胞增殖抑制率达53.25%。

图3 生物碱对肝癌细胞的增殖抑制作用Fig.3 Effect of alkaloid on growth inhibition of hepatocellular carcinoma cell

3 讨论

3.1 超声波辅助兖州卷柏生物碱提取工艺影响

生物碱有效成分的高效提取是中草药开发的关键与难点，新技术的研究与开发能大大提高中草药中生物碱的回收率与质量，并节约大量的时间和能源。超声波作为一种特殊的能量形式，作为一种新技术在中草药有效成分的提取、药物制剂工艺的改进、药物的合成与降解、以及在生物药剂中的运用等方面倍受青睐[7]。陈志慧等[8]用索氏回流、常规浸提、超声波3种方法提取断肠草总碱，结果表明，超声波提取方法生物碱提取效率最高。金艳梅等[9]研究表明，75%乙醇对蒲公英生物碱提取效率最高。李俶等[10]研究表明，乙醇浓度为100%对槲寄生有效成分中生物碱的提取效率最高，而最佳的固液比是1∶30。本研究表明，对兖州卷柏生物碱提取率最高乙醇浓度为70%，而固液比为1∶40，其原因可能是，不同生物体所含生物碱种类有所差异，而不同生物碱在不同浓度乙醇中的溶解度不同。

3.2 兖州卷柏生物碱对肝癌细胞增殖抑制作用

兖州卷柏作为治疗肝炎的中药应用已有悠久历史，《福建民间草药》记载：兖州卷柏具有清肝热，疗黄疸功效。林美珍等[11]使用兖州卷柏治疗20例肝炎患者，得到显著疗效。在广东仁化县等地，民间使用兖州卷柏熬水内服两个疗程（每一疗程为7d）后，可以得到较显著的疗效[12]。张昊[2]研究充州卷柏的四种黄酮类化合物与抗肝癌药物甲氨蝶吟（MTX）和人肝癌细胞HepG2的体外增殖抑制作用，结果表明，4种兖州卷柏黄酮类化合物对体外人肝癌细胞HePG2均有一定的抑制活性。其中化合物6-羟基-2-对羟基苯基-苯并毗喃酮-8-乙酸、4’-甲氧基罗伯斯特双黄酮、罗伯斯特双黄酮、穗花杉双黄酮的抑制活性与MTX相近，而化合物罗伯斯特双黄酮在不同浓度的抑制率和IC50值，都显示出比阳性对照MTX具有更强的抑制活性。本实验结果与以上实验相似，兖州卷柏生物碱对小鼠肝癌H22细胞有显著生长抑制效果。表明兖州卷柏含有抑制肝癌细胞的有效活性成分，其活性成分的鉴定及抗肝癌机制有待进一步研究。

4 结论

超声辅助法是兖州卷柏生物碱提取的有效方法。最佳工艺为：乙醇浓度70%、固液比1∶40、超声时间60min、超声功率400W和超声温度60℃。影响生物碱提取的首要因素是超声功率，其次是超声处理时间和超声温度。不同浓度兖州卷柏生物碱对小鼠H22肝癌细胞均有抑制效果，其中生物碱浓度为8mg/mL时，培养48h对肝癌细胞增殖抑制率达53.25%。

[1]江苏新医学院编．《中药大辞典》[M]．上册.上海：上海科学技术出版社，l446-l447．

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