猪血红蛋白ACE抑制肽的分离和理化性质研究

邓惠玲，刘 嘉，陈光镜，阚建全，*

（1.西南大学食品科学学院，重庆400715；2.农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（重庆），重庆400715）

血管紧张素转化酶（The angiotensin I-converting enzyme，ACE）是一种二肽基肽酶，在血压调节系统中起关键作用。ACE一方面通过水解作用，使不具有催化活性的血管紧张素Ⅰ成为具有促进血管收缩作用的血管紧张素II；另一方面通过降解作用，使具有舒张血管紧张作用的舒缓肌肽失活[1]。ACE酶活性过高会导致高血压病的产生，因此需要服用ACE抑制剂。一些合成的ACE抑制剂，如卡托普利、赖诺普利、卡托普利等被用来治疗高血压和心血管疾病，降压效果显著。但是研究发现，长期使用这些合成抑制剂会导致近44%的病人出现诸如咳嗽、皮疹、味觉失调等副作用[2]。Ferreira[3]首次在美洲矛头蝮的毒液中发现ACE抑制肽，此后，食源性ACE抑制肽受到众多学者的关注，被认为是最有希望取代合成ACE抑制剂的天然活性物质[4]。近年来，从各种食物蛋白质中分离纯化出许多ACE抑制肽，如Anne等[5]从牛奶中分离纯化出了a-1a f105-110，β-lg f9-14，f15-20，as1-cn f142-147，f157-164，f194-199，β-cn f108-113，f177-183和193-1989多肽。Hiroyuki等[6]从鲣鱼肉中分离纯化出Leu-Lys-Pro-Asn-Met五肽。Daodong等[7]从脱脂牛奶中分离纯化出Val-Pro-Pro三肽。Zhao等[8]从海参中分离纯化出Glu-Asp-Pro-Gly-Ala五肽。Wang等[9]从牡蛎中分离纯化出Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe九肽。Hee等[10]从阿拉斯加州鳕鱼皮中分离纯化出Gly-Pro-Leu三肽。ACE抑制肽的降血压活性与其纯度密切相关，目前肽类的分离纯化方式主要包括大孔树脂[11]、凝胶色谱[12]、离子交换色谱[13]、疏水相互作用色谱[14]、高效液相色谱[15]等。本研究以猪血血红蛋白的胃蛋白酶水解液为原料，使用大孔吸附树脂DA201-C和葡聚糖凝胶Sephadex LH-20对其进行初步分离，并对初步分离后具有较高ACE抑制活性的组分进行理化性质研究，旨在为猪血红蛋白ACE抑制肽的工业开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

猪血血红蛋白粉 实验室自制；血管紧张素转化酶（ACE）（纯度2～6U/mg）、马尿酰-组胺酰-亮氨酸（HHL） Sigma公司；Pepsin胃蛋白酶（酶活20万U/g） Sigma公司；胰蛋白酶（酶活1万U/g）、胰凝乳蛋白酶（酶活1万U/g） 南宁东恒华道生物科技有限公司；Sephadex LH-20 美国GE公司；DA201-C大孔树脂（孔径0.315～1.25） 沧州宝恩化工有限公司。

ALPAAI-4LSC型真空冷冻干燥机 德国Chris公司；1-15PK型冷冻离心机 SIGMA公司；LC-20AD型高效液相色谱仪 日本岛津公司；DBS-100型电脑全自动部分收集器 上海沪西分析仪器厂；HL-2型恒流泵 上海沪西分析仪器厂；UV-2450PC型紫外可见分光光度计 SHIMADZU。

1.2 实验方法

1.2.1 猪血红蛋白酶解液的制备[16]取25g猪血红蛋白粉，加入蒸馏水（502mL），配制成4.98%（m/v）底物，以HCl（1mol/L）调节底物pH至1.98，再按照胃蛋白酶∶猪血血红蛋白粉为3∶100（w/w）的比例加入胃蛋白酶进行水解，37.6℃酶解，以HCl维持反应体系的pH恒定。水解4h后，100℃水浴10min灭酶，流水冷却至37℃，以10000r/min，5℃离心10min，收集上清液，真空冷冻干燥后备用。

1.2.2 猪血红蛋白ACE抑制肽的纯化实验

1.2.2.1 大孔树脂DA201-C的分离实验[17]在室温下，将大孔树脂浸泡于95%乙醇中24h，使其充分溶胀；然后用无水乙醇淋洗至220nm处无吸收峰；再用蒸馏水洗至无乙醇味。接着浸泡于5倍体积的5%NaOH中8h，用蒸馏水洗至pH为7；最后浸泡于5倍体积的5%HCl中8h，用蒸馏水洗至pH为7，备用。在层析柱中装满预处理好的大孔吸附树脂DA201-C（2.6cm×50cm），湿法上柱；将浓度为45mg/mL的猪血红蛋白多肽溶液30mL以0.5mL/min的流速流经层析柱，用紫外检测器检测流出液在280nm处的吸光度（A280nm），以A280nm≥0.05时停止上样。将500mL的75%（v/v）的乙醇以1.0mL/min的流速流经层析柱，以A280nm≥0.05时停止上样。收集洗脱液进行旋转蒸发浓缩后真空冷冻干燥，备用。并进行ACE抑制活性的测定和脱盐率[18]测定。

式中，A1为脱盐前样品中的灰分；A2为脱盐后样品中的灰分。

1.2.2.2 葡聚糖凝胶Sephadex LH-20的分离实验[19]在室温下将葡聚糖凝胶LH-20浸泡于55%乙醇中24h后，使其充分溶胀；然后用去离子水洗至无乙醇味，溶胀24h。0.2mol/L的HCl中浸泡12h，用去离子水洗至中性，备用。

在层析柱中装满预处理好的葡聚糖凝胶Sephadex LH-20（1.6cm×100cm），湿法上柱；取0.5g 1.2.2.1中的洗脱组分作为纯化样品溶于10mL超纯水中配成50mg/mL的上样浓度；以去离子水为洗脱剂，流速为0.2mL/min在280nm处检测吸光度，收集不同组分真空冷冻干燥，备用。

1.2.3 ACE抑制活性的测定[20]在试管中依次加入1000μL硼酸盐缓冲溶液（pH 8.3，0.2mol/L）、200μL酶解液以及10μL ACE，把以上混合液放入37℃恒温水浴中保温5min，再加入50μL5mmol/LHHL（pH8.3，0.3mol/L NaCl）于37℃中恒温30min，加入100μL 1mol/L HCl终止反应，至室温，取5μL反应产物过0.45μm水相膜处理后进样，通过反相高效液相色谱洗脱图谱定量马尿酸的生成量，从而计算ACE抑制肽的抑制率，ACE抑制率计算公式如下：

式中，A1为不存在ACE抑制肽时的峰面积；A2为存在ACE抑制肽时的峰面积。

色谱条件：高压液相色谱系统：SHIMADZU LC-20AD；检测器：SPD-M20A；色谱柱：SHIMADZU VPODS 4.6mm×150mm；洗脱液为乙腈：超纯水（24：76，v/v）；洗脱液流速：0.4mL/min；检测波长：228nm，进样量：5μL。

半数抑制浓度（IC50）：指当抑制率为50%时，所需抑制剂的质量浓度（mg/mL）计算方法为：检测多个质量浓度梯度下ACE抑制肽的抑制率，通过SPSS软件的概率系统（Probit）分析获得IC50值。

1.2.4 猪血红蛋白ACE抑制肽的理化性质实验

1.2.4.1 猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）的溶解性实验[21]取0.5g经Sephadex LH-20分离得到的组分α-Ⅱ，加入30mL去离子水中，以1mol/L HCl和1mol/L NaOH调节pH2.0～10.0，室温下50r/min搅拌1h；9000r/min离心20min，取上清液测定其中的蛋白质含量[22]，公式如下：

式中，M1为样品的质量；M2为上清液中的肽含量。

1.2.4.2 猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）的模拟消化道环境稳定性实验[23]取0.1g经Sephadex LH-20分离得到的组分α-Ⅱ用去离子水配成1mg/mL的溶液（样品溶于0.1mol/L的KCl-HCl缓冲液，pH2.0）中，以1mol/L HCl调节pH到2.0，加入胃蛋白酶∶ACE抑制肽（α-Ⅱ）为1∶100（w/w）的比例加入胃蛋白酶于37℃下水解4h。反应结束后将其置于100℃水浴10min灭酶；并以1mol/L NaOH调节pH至7.0，取50mL水解液在5000r/min下离心15min，测定上清液的ACE抑制活性。在剩余的50mL水解液中再加入胰蛋白酶∶胰凝乳蛋白酶∶ACE抑制肽（α-Ⅱ）为1∶1∶100（w/w/w）的比例加入胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶于37℃下水解4h。反应结束后将其置于100℃水浴10min灭酶。再取适量水解液于5000r/min离心15min，测定上清液的ACE抑制活性。

1.2.4.3 猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）的热稳定性实验[24]取0.1g经Sephadex LH-20分离得到的组分α-Ⅱ用去离子水配成1mg/mL的溶液，以1mol/L HCl和1mol/L NaOH调节pH7.0，分别置于温度为25、35、45、55、65、75、85、95℃下水浴2h，再测定其ACE抑制活性。

1.2.4.4 猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）的pH实验[25]取0.1g经Sephadex LH-20分离得到的组分α-Ⅱ用去离子水配成1mg/mL的溶液，调节HAc-NaAc缓冲溶液的pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10，室温放置2h，再测定其ACE抑制活性。

1.2.4.5 猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）的盐稳定性实验[26]取0.1g经Sephadex LH-20分离得到的组分α-Ⅱ分别溶于0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mol/L的NaCl溶液中，浓度为1mg/mL，室温放置2h，再测定其ACE抑制活性。

1.2.5 数据处理方法 实验数据均是经过3次平行实验得到的平均值，并计算其误差，SPSS18.0分析数据之间的相关性，Simaplot10软件作图。

2 结果与分析

2.1 猪血红蛋白ACE抑制肽的分离实验结果

图1 Sephadex LH-20分离猪血红蛋白ACE抑制肽的HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of ACE inhibitory peptides from porcine hemoglobin separated after Sephadex LH-20

表1 不同分离方法得到的分离组分的ACE活性抑制比较Table 1 Comparison of inhibition of ACE activity of fractions prepared by different separation methods

从表1和图1可知，与酶解原液相比，分离后的组分IC50差异极显著（p＜0.01）。经过大孔树脂DA201-C分离的组分ACE抑制活性明显提高，其IC50为0.87，脱盐率为94.52%；再经过葡聚糖凝胶Sephadex LH-20的分离，洗脱出3个组分，各个组分的ACE抑制活性与经过大孔树脂DA201-C分离的组分相比也均有提高；其中组分α-Ⅱ的抑制活性最强，IC50为0.21。根据凝胶过滤色谱的分离原理，分子量大的组分先出峰，分离量小的分子后出峰，由此可知，其分子量大小顺序为：α-Ⅰ＜α-Ⅱ＜α-Ⅲ。

2.2 猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）的溶解性实验结果

图2 猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）的溶解性Fig.2 Solubility of ACE inhibitory peptides from porcine hemoglobin（α-Ⅱ）

从图2可知，猪血红蛋白ACE抑制肽α-Ⅱ的溶解性在pH7附近最低，溶解度仅为50.37%。而升高或降低pH，其溶解度均有所提高。这可能是由于血红蛋白ACE抑制肽α-Ⅱ是由不同氨基酸组成的短肽，该短肽的等电点位于pH7附近。因此，在这个范围内，分子间没有作用力，容易聚集，导致溶解度降低；加入酸或碱以后，氨基酸与酸或碱结合，分子间电荷互相排斥，不易聚集，继而溶解度变大。

2.3 猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）的模拟消化道环境稳定性实验结果

表2 消化酶对猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）活性的影响Table 2 Effect of digestive enzyme on the activity of ACE inhibitory peptide（α-Ⅱ）from porcine hemoglobin

从表2可知，猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）经消化酶水解后ACE活性变化不大。跟空白组比较，胃蛋白酶水解后组分的IC50变化不明显，差异不显著（p＞0.05），这说明胃蛋白酶对猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）的活性影响非常小；经胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解后的组分的IC50增加了4%，这可能是因为胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解了少部分多肽，打断了某些具有活性的肽段，从而降低了猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）的活性。

2.4 猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）的热稳定性实验结果

由图3可知，猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）在不同温度下水浴2h后，其ACE抑制活性差异显著（p＜0.05）有一定的变化。随着温度的升高，猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）的IC50也逐渐增大。当温度在25～55℃时，猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）的活性无显著变化（IC50：0.20～0.25）；继续升高温度，猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）的IC50也迅速增大，当温度达到95℃时，其IC50增大到1.93mg/mL。由此可知，高温对猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）的活性影响较大。

图3 温度对猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）活性的影响Fig.3 Effect of temperature on the activity of ACE inhibitory peptide（α-Ⅱ）from porcine hemoglobin

2.5 猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）的pH实验结果

图4 pH对猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）的ACE抑制活性的影响Fig.4 Effect of pH value on the activity of ACE inhibitory peptide（α-Ⅱ）from porcine hemoglobin

从图4可知，当pH在2～7之间时，猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）的活性变化幅度很小，猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）的IC50维持在0.21mg/mL附近。当pH大于7时，其IC50值迅速增大；当pH为10时，其IC50增大为0.37mg/mL。由此可知，猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）在中性和偏酸性的条件下比较稳定。

2.6 猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）的盐稳定性实验结果

在胃蛋白酶水解猪血红蛋白的过程中，需要不断地加入HCl和NaOH维持体系的pH恒定不变。酶解液在经过DA201-C大孔树脂脱盐后，其ACE抑制活性有了明显提高。从图5可知，当NaCl浓度为0.2～0.6mol/L时，猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）的IC50均在0.20～0.21mg/mL的范围内小幅波动；当NaCl浓度超过0.6mol/L时，其IC50迅速增大；当NaCl浓度为1.2mol/L时，IC50为0.33mg/mL。由此可知，在浓度低于0.6mol/L的NaCl溶液中猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）的活性变化小，但当其浓度较高于0.6mol/L时，就会显著降低猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）的活性。由此可以进一步证明使用DA201-C大孔树脂对其脱盐作用是很明显的。

图5 NaCl浓度对猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）的ACE抑制活性的影响Fig.5 Effect of NaCl concentration on the activity of ACE inhibitory peptide（α-Ⅱ）from porcine hemoglobin

3 结论

3.1 猪血红蛋白的胃蛋白酶水解液经大孔树脂DA201-C和葡聚糖凝胶Sephadex LH-20的初步分离后，其ACE抑制活性具有明显提高，与酶解原液相比，其IC50最大下降了86%。

3.2 猪血红蛋白ACE抑制肽（α-Ⅱ）在pH7时溶解度最小，为50.37%；经消化酶水解后ACE抑制活性变化不大；在温度为25～55℃时，ACE抑制活性波动不明显；在中性和偏酸性的条件下比较稳定，在NaCl浓度小于0.6mol/L时，ACE抑制活性较稳定。

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