微囊乳钙补钙剂的测定研究

肖 珊，黄立新，郭 峰

（1.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640；2.广州双桥股份有限公司，广东广州510280）

人体几乎所有的生理活动均需要钙的参与，其代谢平衡是维持生命和健康的重要因素。我国国民钙摄入量普遍偏低，平均每人每天为400～500mg，仅达到推荐量的50%左右；儿童青少年的缺钙更为严重，有70%～80%的儿童钙摄入量不足推荐量的50%[1]。因此，在当今食品行业，钙强化是一个重要的产品概念，钙强化产品不断出现。2011年，无论全球还是亚洲食品饮料市场中，钙强化产品数量较2010年均增长了7.5%[2]。市场上钙制剂种类繁多，总数达上千种。到目前为止，经国家食品药品监督管理局（SFDA）批准的钙制剂保健食品有896个，钙类药品多达1740个，主要分为四大类：无机钙、有机酸钙、氨基酸螯合钙、肽钙[3]。尽管补钙产品种类丰富，但其钙生物利用度都受到不同程度的限制，导致补钙效果与补钙量不成正比。其中，无机钙盐具有价廉、钙含量高等优点，作为食品添加剂被广泛用于各类食品。大多数无机钙盐水溶性小，进入体内后需大量胃酸解离成Ca2+才能被吸收利用，但溶解后，在胃肠内容易与其他阴离子发生反应，产生沉淀，因此生物活性较差；当胃酸缺乏时，不能充分解离成Ca2+，生物利用度较低，并且有一定的副作用，较易引起胃肠道刺激症状[4-5]。

近年，国外采用微囊化技术用卵磷脂将富含钙的乳矿物盐包埋起来，开发出微囊化钙产品[6]。微囊化钙因被卵磷脂包裹，服用后不受胃酸分解，可顺利抵达肠道吸收部位，不刺激胃；壁材卵磷脂的结构与肠道上皮细胞膜结构非常相似，很大程度上提高钙的生物利用率和吸收率[7]。国外已将微囊乳钙添加于亨氏超金系列等多种配方奶粉中，国内在2011年的补钙产品中“合生元微囊乳钙咀嚼片”也添加了进口微囊乳钙粉。目前，我国尚无生产微囊乳钙剂的报道，本文对一种进口的微囊乳钙产品进行结构、成分与性质的测定研究，为国内补钙产品的研发与生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

微囊乳钙粉（进口） 取自海关；浓缩乳清蛋白WPC80 美国Hilmar公司；大豆卵磷脂 北京索莱宝科技有限公司，优级纯；无水乙醇 天津富宇精细化工有限公司，分析纯。

S3700N扫描电镜 Hitachi公司；NICOLET-6700红外光谱仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；S4 PIONEER X-射线荧光光谱仪 德国BRUKER公司；UV500紫外可见分光光度计 英国UNICAN；X’Pert PRO X-射线衍射光谱仪 荷兰帕纳科公司；TGA Q500热重分析仪 美国Waters公司；TDL-5-A离心机 上海安亭（飞鸽）；DDS-307电导率仪 上海雷磁；KJETTEC TM2400 YQ23-凯氏定氮仪 瑞典FOSS；S-250D超声波萃取仪 美国BRANSON公司。

1.2 实验方法

1.2.1 微囊乳钙的显微形貌 将样品、样品灰分（600℃下灼烧4h）用导电胶将固定在样品台上，真空喷金处理，放入电镜中，观察拍摄样品颗粒形貌。1.2.2 测定分析

1.2.2.1 微囊乳钙中水分含量的测定 参照GB/T 20884-2007。

1.2.2.2 微囊乳钙中蛋白质含量的测定 采用凯氏定氮仪测定样品及乳清蛋白的蛋白质含量。以乳清蛋白为标准品，用紫外分光光度法[8-9]绘制A-C标准曲线。准确称微囊乳钙样品2.00g，置于50mL烧杯中，加入0.1mol/mL柠檬酸溶液30mL，不断搅拌10min使其充分溶解，以3000r/min的速度离心10min，倾出上清液保存为储备液。吸取2.0mL滤液于10mL容量瓶中，加8mol/L尿素的氢氧化钠溶液定容，充分振摇2min，将滤液置于比色皿记录吸光值，从标准回归方程计算出测定样品蛋白质含量。

1.2.2.3 微囊乳钙TGA热重分析 样品质量约2.5mg。氮气流量：天平40mL/min，样品60mL/min，升温速率为：30℃/min，温度范围为25～800℃。

1.2.2.4 微囊乳钙红外光谱分析 采用KBr压片法，累加扫描次数32次。

1.2.2.5 微囊乳钙X射线衍射分析 采用粉末衍射法，铜靶；管压管流；40kV，40mA；步长0.05°；扫描速度14.28s/步；扫描范围4～80°。

1.2.2.6 微囊乳钙X-射线荧光光谱分析 采用硼酸压片法，微囊乳钙干燥样品选取maxtrix进样模式，样品灰分选取Oxide进样模式，条件为：Rh靶；管电压：50kV；管电流：50mA；真空光路；气体流量：35mL/min。测定微囊乳钙所含元素及大致比例，以及灰分中各种氧化物含量，再计算得到微囊乳钙原样品中钙、磷等元素大致含量。

1.2.3 微囊乳钙溶解性的测定 称取样品1g至于100mL蒸馏水中混匀，磁力搅拌条件下，不断加入1mol/L的盐酸溶液，同时测定溶液pH与电导率。以pH为横坐标，电导率为纵坐标绘制曲线。同时称取样品1g至于100mL蒸馏水中混匀，磁力搅拌条件下，不断加入与盐酸同体积的蒸馏水，做同条件下的空白实验。

2 结果与讨论

2.1 微囊乳钙的显微电镜形态

微囊乳钙原样与其灰分的电镜图如图1、图2所示。由图2可知，微囊乳钙颗粒大小不均，粒径约2～100μm，表面凹凸严重，有少量裂纹。样品灰分为粒径在4～5μm的颗粒。

图1 微囊乳钙原样的电镜显微照片（左：300×；右：1000×）Fig.1 Electron micrograph of MMC（left：300×；right：1000×）

图2 微囊乳钙灰分的电镜显微照片（左：500×；右：2000×）Fig.2 Electron micrograph of MMC ash（left：500×；right：2000×）

2.2 微囊乳钙产品的成分分析

2.2.1 微囊乳钙的水分含量 微囊乳钙样品水分含量为8.44%±0.01%，说明此产品不易吸潮，易储存。

2.2.2 微囊乳钙的蛋白质含量 以乳清蛋白为标准绘制的A-C标准曲线如图3所示，其回归方程为：y=12.03x-0.015，相关系数R2=0.998，当蛋白质溶度在0.0959～0.959mg/mL的范围内，吸光值A与溶度C之间呈良好的线性关系，可按标准曲线法进行定量分析。按1.2.2.2的方法，取微囊乳钙1.9464g，测得溶液吸光度为0.022，可得样品中蛋白质的含量为1.93%。此结果比凯氏定氮方法所得的2.14%小，这是因为由于微囊乳钙中含有卵磷脂（参见2.2.4），而卵磷脂中含氮元素，导致凯氏定氮法测得蛋白质含量较实际值偏高。

图3 乳清蛋白280nm处A-C标准曲线Fig.3 A-C standard curve of whey protein in 280nm

2.2.3 微囊乳钙的TGA热重分析 样品的热重曲线见图4，在25～105℃过程中，样品质量快速下降，主要为水分散失过程；温度从105～550℃过程中，样品质量以较上阶段稍慢的速度下降，此阶段为大部分的有机物转化成气体散失的过程；当温度升高至约643℃，样品质量降至最低点，此时有机物被完全除去；之后随温度继续上升，样品质量略增加0.4%左右，此阶段可能为其中的一些无机元素生成氧化物的过程。样品灰分含量约为78.5%～78.9%之间。可见，要用马弗炉准确测定微囊乳钙一类样品的灰分含量，灼烧温度需至600℃或稍高。

图4 微囊乳钙样品的热重曲线图Fig.4 Thermogravimetric curve of MMC

2.2.4 微囊乳钙的红外光谱分析 卵磷脂能溶于乙醇，样品采用乙醇超声波辅助萃取[10-13]后得到的物质与大豆卵磷脂乙醇溶液的红外光谱见图5，两条曲线出峰位置与峰强度基本相同，可见，微囊乳钙中的壁材含有卵磷脂。

图5 样品乙醇萃取物质的傅立叶红外光谱Fig.5 Fourier infrared spectrum of MMC ethanol extraction

微囊乳钙干燥样品及600℃灼烧4h的灰分样品的傅里叶红外光谱如图6所示。样品灼烧后余下的白色物质主要为一些非金属氧化物，由此可知，于波长3413、2917、2850、1616、1414、884cm-1处均有有机物组分出峰，样品灼烧后均消失。根据红外光谱出峰位置所在波长，查阅标准数据库[14]，分析结果可知，3413cm-1为胺类物质的N-H伸缩振动峰，2917cm-1、2850cm-1为铵盐的N-H伸缩振动峰，1414cm-1为羧酸中O-H的弯曲振动峰，这些应为蛋白质中的氨基与羧基所有的特征峰；1616cm-1为酰胺（RCONH2）中NH弯曲振动峰，此应为卵磷脂中的酰胺基所有的特征峰。1036cm-1、977cm-1为P-O伸缩振动峰，602cm-1、563cm-1为钙盐峰，这表明微囊乳钙样品中还可能含有磷酸钙盐。

图6 微囊乳钙与其灰分的傅立叶红外光谱Fig.6 Fourier infrared spectrum of MMC and its ash

2.2.5 微囊乳钙的X射线衍射分析 微囊乳钙干燥样品（a）及600℃灼烧4h灰分（b）的X射线衍射图谱见图7。由曲线a可见，微囊乳钙干燥样品在衍射角26°及32°左右出现两个峰，峰强度较弱，出峰较宽，样品晶型较不明显。采用MDI-JADE软件进行物相检索，结果显示匹配度最高和较高的均为磷酸钙盐。由曲线b可见，当把样品在600℃灼烧4h得到的灰分进行测定后，在衍射角26°、29°、32°、35°处出现了强度大且明显的尖峰，样品灰分有明显的晶型结构，采用MDI-JADE软件进行物相检索，结果显示是磷酸与钙、镁、铁等的复合盐。

图7 微囊乳钙的X-衍射图谱Fig.7 X-ray diffraction pattern of MMC

2.2.6 微囊乳钙的X-射线荧光光谱分析 在Maxtrix测定模式下，微囊乳钙的X-射线荧光光谱分析结果如表1。微囊乳钙的囊心是乳矿物盐，即以乳清为原料，经超滤、热处理、离心、微滤去除部分蛋白质、乳糖成分后，再用巴氏消毒、喷雾干燥，最后得到的产物[15]。从分析结果可知，乳矿物盐中仍含有有机物，另外，还含有Ca、P、Mg、K、Cl、Na、Zn等元素。其中，Ca、P两种元素占主要部分，并且二者比例接近2∶1。人体骨骼中钙磷含量的比例为2∶1，专家对膳食中的钙磷的比例进行了研究，认为成人为1∶1～2∶1、婴儿（1岁以下）为1.5∶1时，最有利于钙的吸收。而Zn、Fe、Mg这3种元素含量较低，可减少与钙之间的拮抗作用[16]。

表1 微囊乳钙-X射线荧光光谱分析结果Table 1 X-ray fluorescence spectrum analysis of MMC

在Oxide测定模式下，样品灰分（600、800℃下灼烧4h）的X-射线荧光光谱分析结果如表2。600℃下灼烧的灰分与800℃下灼烧的灰分相比，后者的CaO含量较高，P2O5含量较低，表明在800℃高温灼烧时有少部分的磷散失了，故应选取600℃灼烧测定灰分。600℃下，灰分含量为78.9%，其中CaO、P2O5的含量分别为43.5%、29.1%，则微囊乳钙样品中Ca、P的含量分别约为24.5%、10.1%，其钙磷比亦接近2∶1，与原样品X射线荧光光谱分析结果基本一致。另外，X-射线荧光光谱分析也表明微囊乳钙中含有磷酸钙盐。

表2 微囊乳钙灰分X射线荧光光谱分析结果Table 2 X-ray fluorescence spectrum analysis of MMC ash

2.3 微囊乳钙的溶解特性

将微囊乳钙混于水中，调节pH的同时，测定溶液电导率，所得pH-电导率曲线如图8所示，部分实际照片见图9。未去除CO2的蒸馏水的pH为5.2，微囊乳钙混于水中时pH为7.17，表明样品本身含碱性成分，溶液呈乳白色。在pH4.73～7.17之间，微囊乳钙溶液电导率变化平缓，说明在此pH范围内，微囊乳钙微溶于水。当pH从4.73降至4.0过程中，溶液越来越透明澄清，微囊乳钙壁材逐渐破裂，囊心中的乳矿物盐也逐渐暴露溶解到溶液中，导致电导率升高速率明显加快。当pH从4.0降至3.60过程中，溶液电导率趋于平缓。当pH低于3.6后，溶液电导率超过仪器量程。但从图9可观察到：pH至2.70时，溶液基本透明，微囊乳钙基本溶解完全。

实验结果说明，要保持微囊乳钙壁材完好地包裹芯材，保护钙的良好吸收特性，则溶液最好为弱酸性或中性溶液，pH不得低于5.05（曲线转折点）。

图8 微囊乳钙溶液与水pH-电导率曲线Fig.8 pH-conductivity curve of MMC solution and distilled water

图9 微囊乳钙溶液不同pH照片Fig.9 Pictures of MMC solution under different pH

3 结论

3.1 此微囊乳钙样品微胶囊颗粒大小不均，粒径约2～100μm，表面凹凸，约含钙24.5%、磷10.1%、蛋白质1.93%，并含有微量的钾、镁、锌、铁等元素。其中，囊心钙主要以磷酸钙盐的形式存在，壁材有卵磷脂。

3.2 微囊乳钙部分溶解于pH小于5左右的弱酸性溶液，完全溶解于pH小于2.7酸性溶液。

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