响应曲面法优化酪蛋白磷酸肽的制备

曹文辉，王志耕，梅 林，薛秀恒

（安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽省乳品工程技术研究中心，安徽合肥230036）

酪蛋白磷酸肽（Casein Phosphopeptides，CPP）是以牛奶酪蛋白为原料，经过蛋白酶水解，再分离纯化之后得到的含有磷酸丝氨酰基的多肽。其活性中心是成串的磷酸丝氨酸和谷氨酸簇，其核心结构可表示为-Ser（P）-Ser（P）-Ser（P）-Glu-Glu-[1]。CPP具有促进钙、铁和锌等微量元素的吸收与利用，还具有抗氧化、促进益生菌增殖等作用[2-7]，由于其稳定性好、有多种生物活性因此具有相当大的开发应用潜力[8-9]。国外研究采用多种蛋白酶酶解酪蛋白，成功地制备出不同种类的CPP[10]，之后也有研究采用RP-HPLCESL-MS/MS方法成功地分离出12种CPP[11]。我国CPP的相关研究相对滞后，有研究采用反相C18液相制备色谱柱，制得了4种不同组分的CPP[12]，但在CPP的常规酶法制备方法上，研究基本以水解度为指标，探讨酪蛋白的单酶、多酶水解条件优化，而以目标产物CPP的得率为指标进行酶解条件优化的研究开展较少。本文选择具有可释放CPP链段更短、产率高、含磷量高[13]等优点的碱性蛋白酶为工具酶，以CPP的得率为指标，采用Plackett-Burman设计和响应面分析法相结合的方法，研究获得较高CPP得率的酪蛋白水解液优化条件，为CPP的有效制备提供技术参数。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酪蛋白（高纯级：95%） AMRESCO；碱性蛋白酶（Alkaline Protease） RUIBIO公司；其他试剂 均为分析纯。

实验HJ-3型控温磁力搅拌器、HH-S型恒温水浴锅 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂；BS210S型电子天平 北京赛多利斯天平有限公司；SJ-3F型精密pH计 上海雷磁仪器厂；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；Allegra 64R CentrifugeBECKMAN COULTER。

1.2 实验方法

1.2.1 酶活的测定

1.2.1.1 标准曲线的绘制 精确称取标准酪氨酸100mg，逐步加入1mol/L盐酸6mL使溶解。用0.2mol/L的盐酸溶液溶解，定容至100mL，再配制成不同浓度的酪氨酸溶液。取不同浓度的酪氨酸溶液各1mL，分别加入0.4mol/L碳酸钠溶液5mL，酚试剂1mL。置于40℃恒温水浴中显色20min，用分光光度计在660nm处测吸光值，并同时做空白管（只加水、碳酸钠和酚试剂）对照，以吸光值为纵坐标，以酪氨酸的微克数为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.1.2 酶活力的测定 取3支试管，编号，各吸取2%的酪蛋白溶液1mL，在40℃水浴中预热2min后加入同样预热的酶液（稀释2000倍）1mL，立即计时。反应10min后，立即加入0.4mol/L三氯乙酸溶液2mL，保温20min后，用滤纸过滤，取上清液。另取3支试管，编号，各加入上清液1mL，然后各加入0.4mol/L的碳酸钠溶液5mL，混匀后再各加入酚试剂1mL。立即混匀，在40℃显色20min。在660nm处测定吸光值。对照组测定方法同上，但在加酪蛋白之前先加0.4mol/L三氯乙酸2mL，使酶失活，再加入酪蛋白。

规定在40℃和pH10.0的条件下，水解酪蛋白每分钟产生酪氨酸1μg为一个酶活力单位。

酶活力单位=（A样-A对）×K/10×4×N 式（1）

式中，A样为样品液的吸光值；A对为对照液的吸光值；K为标准曲线上吸光值为1时的酪氨酸微克数；10为酶促反应时间（min）；4为所测溶液的体积数（mL）；N为酶液的稀释倍数。

1.2.2 酪蛋白的水解 取一定量的酪蛋白，溶于60～70℃的一定浓度的碱性溶液中，配成一定底物浓度的酪蛋白，放入水浴锅中，用0.5mol/L的NaOH调pH至实验设计值，加入适量碱性蛋白酶，保温至水解结束，沸水浴灭酶10min，冷却至室温，用2mol/L的HCl调pH至4.6，离心（8000r/min，10min）去除沉淀，取上清液。

1.2.3 CPP的制备 上述上清液→加10%的CaCl2使其终浓度为1.0%和2倍体积的无水乙醇→离心（8000r/min，10min）→取沉淀→烘干（80℃，4h）→称重。

CPP得率（mg/mL）=（m2-m1）/v 式（2）

式中，m2为烘干之后称量瓶和CPP的重量（mg）；m1为烘干之前称量瓶的重量（mg）；v为所取1.2.2中上清液的体积数（mL）。

1.3 实验设计

1.3.1 Plackett-Burman法筛选影响CPP得率的酶解主要因素 采用Plackett-Burman法，设计2水平实验，实验因素和水平如表1所示。

表1 Plackett-Burman实验因素及水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

1.3.2 最陡爬坡实验 根据1.3.1的结果，影响CPP得率的酶解因素中温度、pH、底物浓度、时间均为正效应，应增大，酶底比为负效应，应减小。其中温度、pH、底物浓度三个因素影响较大。为此，确定酶解时间（4.5h）、酶底比（1.5%）为固定因子。因底物浓度的增大会使溶液的粘稠度相应增大，过大的粘稠度会给实际操作造成难度，亦不利于工业化的生产。为此，根据预实验结果，将底物浓度固定为11%，对温度、pH两个因素实施最陡爬坡实验。

最陡爬坡实验设计为：温度起点50℃，变化步长为5℃；pH起点为10.5，变化步长为0.5。

1.3.3 响应面实验优化水解条件 根据CCD响应曲面设计的中心组合实验设计原理，并结合单因素实验结果，采用3因素5水平的中心组合实验设计方法对水解条件进行优化设计。

根据最陡爬坡实验结果，以第二组为中心点施行中心组合实验。因为有3个自变量，为使拟合响应方程具有旋转性和通用性，选择中心点实验数为6，星号臂长1.682。各自变量水平见表2。

表2 中心组合实验的因素及水平设计Table 2 Factors and levels design of central composite experiments

2 结果与分析

2.1 酪氨酸标准曲线

参照SB/T 10317-1999的方法测定蛋白酶的酶活力，根据实验测定的结果，绘制吸光度值与酪氨酸浓度之间的标准关系曲线，如图1所示。

图1 酪氨酸标准曲线Fig.1 Standard curve of Tyrosine

2.2 碱性蛋白酶的活力

为准确确定酶的添加量，提高实验精度，对商品酶的活力进行测定。实验所选用的碱性蛋白酶的实测活力为35348U/g。

2.3 影响CPP得率的酶解主要因素

Plackett-Burman法筛选酶解酪蛋白获得CPP的主要因素的实验结果见表3。

由表3可知，影响CPP得率的5个因素中，温度、pH、底物浓度、时间对CPP的得率表现为正效应（Exi＞0），应增大，酶底比对CPP的得率表现为负效应（Exi＜0），应减小。影响CPP得率的最主要的三个因素为：底物浓度、温度、pH确定酶底比为1.5%，时间4.5h。故确定可选取这三个因素进行下一步的优化。

表3 Plackett-Burman实验设计与结果Table 3 The Plackett-Burman exprimental design and results

2.4 最陡爬坡实验

最陡爬坡实验结果见表4。由表4可知，第二组的CPP得率最高，故选择第二组作为实验中心点，进行下一步的实验。

表4 最陡爬坡实验结果Table 4 Experimental results of steepest ascent path

2.5 响应面实验优化水解条件

CCD响应曲面设计的中心组合实验的结果见表5。

表5 中心组合实验结果Table 5 Results of central composite experiments

根据表5的实验结果，用Design-Expert 8.06软件进行多元回归拟合，得到二次回归方程：

Y=26.97+0.26X1+4.49X2+0.61X3-0.24X1X2-0.37X1X3-0.36X2X3-0.86X12-0.87X22-0.52X32。

回归方程的模型显著性分析、失拟显著性分析以及回归系数显著性分析见表6。

表6 拟合二次多项式模型的方差分析Table 6 Variance analysis of fitted quadratic polynomial model

从表6的结果分析中可以看出，模型显著，失拟项不显著，决定系数（R2）为0.9844，校正系数（R2Adj）为0.9703，说明该回归模型与实际值拟合程度高。回归模型中一次项中的X2、X3和二次项表现显著，一次项中的X1和交互项表现不显著。利用软件得到的响应面图见图2～图4。

图2 底物浓度和温度对CPP得率的响应曲面图Fig.2 Response surface of substrate concentration andtemperature on the extraction rate of CPP

从图2中可以看出，底物浓度对CPP得率的影响曲线呈不断上升的趋势，温度对CPP得率的影响曲线较平缓。结合图2及表6中的方差分析，底物浓度对CPP得率的影响显著（p＜0.01）；在实验设定温度范围内，温度对CPP得率的影响不显著（p＞0.05）；底物浓度和温度的交互作用对CPP得率的影响不显著（p＞0.05）。

图3 pH和温度对CPP得率的响应曲面图Fig.3 Response surface of pH and temperature on the extraction rate of CPP

从图3中可以看出，pH对CPP得率的影响曲线呈现先快速上升后略有下降的趋势，温度对CPP得率的影响曲线呈现先上升后略有下降的趋势。结合图3及表6中的方差分析，pH对CPP得率的影响显著（p＜0.01）；温度对CPP得率的影响不显著（p＞0.05）；pH和温度的交互作用对CPP得率的影响亦不显著（p＞0.05）。

图4 pH和底物浓度对CPP得率的响应曲面图Fig.4 Response surface of pH and substrate concentration on the extraction rate of CPP

从图4中可以看出，底物浓度对CPP得率的影响曲线呈不断上升的趋势，pH对CPP得率的影响曲线较平缓。结合图4及表6中的方差分析，pH对CPP得率的影响显著（p＜0.01）；底物浓度对CPP得率的影响显著（p＜0.01），且底物浓度对CPP得率的影响大于pH对CPP得率的影响；底物浓度和pH的交互作用对CPP得率的影响亦不显著（p＞0.05）。

2.6 模型的验证

利用软件求解回归方程，得到最佳CPP得率的工艺条件为：温度54.16℃、底物浓度16.3%、pH10.87，在此条件下得到的CPP得率为32.8mg/mL。考虑到实际操作的情况，将工艺条件调整为：温度55℃、底物浓度16%、pH10.8，在酶底比1.5%、时间4.5h的情况下，验证实验CPP得率为33.2mg/mL，实际值与预测值之间相对误差为1.22%，在可接受范围。

3 讨论

现有一些研究结果表明，酪蛋白酶解过程中，CPP的释放与水解度只呈现一定的正相关关系，当酪蛋白水解度达到16%时，大部分CPP已释放出来，所以在CPP生产过程中可不必使水解度达到最大值[14]。有鉴于此，本研究尝试采用CPP的得率为指标进行条件优化，取得较好结果，最优条件下，可获得33.2mg/mL浓度得率的CPP，表明这一路径是可行的，但与现行水解度为指标的技术方案优劣的系统比较研究尚有待进行。

在本研究实验结果中，图2温度对CPP得率的影响和图4中pH对CPP得率的影响的响应面变化趋势基本一致，这与方差分析结果：温度对CPP得率的影响不显著、pH对CPP得率的影响显著不一致。分析认为，可能是因为底物浓度对CPP得率的影响效应较大，从而掩盖了pH对CPP得率的影响。为此，可以采用固定底物浓度（使CPP有较高的得率且不会产生过大的粘稠度给实际操作造成难度）的方式，优化CPP得率的其他影响因素，这有待于进一步的研究。

4 结论

底物浓度、温度和pH是影响碱性蛋白酶酶解酪蛋白制备CPP得率的主要因素，其最优水解条件为：温度55℃、底物浓度16%、pH10.8、酶底比1.5%，时间4.5h，在此条件下，水解所得到的CPP得率为33.2mg/mL。

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