寡克隆区带及抗水通道蛋白4抗体在多发性硬化诊断中的意义

覃惠洵 刘琳琳 郝洪军 刘凤君 高 枫

北京大学第一医院神经内科 北京 100034

MS是一种以中枢神经系统炎性多灶性脱髓鞘为特征的自身免疫性疾病，其临床表现复杂多变，可表现为运动无力、肢体轻瘫、感觉异常、视力障碍、复视、眼球震颤、构音障碍、意向性震颤、癫、共济失调、深感觉障碍和括约肌功能障碍等，主要特征为空间多发性和时间多发性［1］。因为该病有较高的发病率、慢性病程及青壮年易感性，目前越来越受到临床的重视。本研究通过回顾性分析MS患者与对照组患者OCB、脑脊液及血清抗AQP4 抗体的差异，以观察MS患者的OCB、脑脊液及血清抗AQP4抗体阳性率。

1 资料与方法

1.1 临床资料 30例MS组患者为2011-04—2012-02北京大学第一医院门诊或住院确诊为MS患者，均符合2010 版MS McDonald 诊 断 标 准［2］，男11 例，女19 例，平 均 年 龄（33.5±10.5）岁；48例NND 组患者为同期北京大学第一医院门诊就诊或住院收治的诊断为NND 的患者（诊断包括中枢神经系统肿瘤、动脉硬化性脑梗死、癫、运动神经元病、线粒体病等），男21例，女27例，平均年龄（36.5±13.4）岁；50例外科手术组患者为同期北京大学第一医院住院收治的采用腰麻作为麻醉方式的外科手术患者（诊断包括泌尿系结石、前列腺增生或外伤性骨折等非神经系统疾病），男30例，女20例，平均年龄（39.1±12.0）岁。3组患者性别与年龄差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。所有研究对象均就诊后送检血清及脑脊液标本至北京大学第一医院神经免疫室行OCB及抗AQP4抗体检测。所有研究对象就诊前均未使用过任何激素或其他免疫抑制剂类药物治疗。

1.2 方法

1.2.1 研究方法：采用回顾性分析法，对比分析MS 组、NND 组及外科手术组OCB、脑脊液及血清抗AQP4抗体阳性率的差异，以评价OCB 及抗AQP4 抗体在MS诊断中的意义。

1.2.2 实验方法

1.2.2.1 OCB测定：使用sebia HYDRASYS 2系列仪器进行检测。采用等电聚焦电泳的分离方法，在PH 值3.0～10.0范围内将脑脊液及对照血清标本进行电泳分离，将分离的蛋白条带用碱性磷酸酶标记的人IgG 抗体再进行免疫固定，然后进行蛋白区带酸性二甲基甲酰胺（TTF3）染色，观察结果。根据患者脑脊液及对照血清检测结果的对比情况，国际上分为以下5种表现类型：Ⅰ型，脑脊液及血清均未见不连续的蛋白条带；Ⅱ型，脑脊液出现两条或两条以上不连续的蛋白条带，而血清未出现蛋白条带；Ⅲ型，脑脊液及血清均出现两条或两条以上不连续的蛋白条带，但脑脊液存在不同于血清的蛋白条带；Ⅳ型，脑脊液及血清均出现两条或两条以上不连续的蛋白条带，且脑脊液的蛋白条带与血清的蛋白条带完全相同；Ⅴ型，脑脊液及血清均出现相同区域的数条蛋白条带。根据OCB的判定标准，Ⅱ型及Ⅲ型定为OCB阳性。

1.2.2.2 抗AQP4抗体的测定：用纯化的AQP4全肽段作为包被抗原，制成固相载体，往包被微孔板依次加入样本，再加入阳性对照及阴性对照，37℃孵育120 min后洗板，再加入生物素化的AQP4抗体，37℃孵育60min后再洗板，再加入生物素化的蜡根过氧化物酶，37℃孵育60min后洗板，加入显色底物液，加入终止液，在伯乐680酶标仪450nm 波长读取光密度值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，多组计量资料比较采用方差分析，计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NND 组与外科手术组OCB、脑脊液及血清抗AQP4抗体阳性率的比较 48 例NND 组患者中，OCB、脑脊液抗AQP4抗体及血清抗AQP4抗体阳性者各2例；50例外科手术组患者中，OCB阳性者0例，脑脊液及血清抗AQP4抗体阳性者各1例。经比较，2组患者OCB、脑脊液抗AQP4抗体及血清抗AQP4抗体的阳性率差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 NND 组与外科手术组OCB、脑脊液及血清抗AQP4抗体阳性率比较

表2 MS组与对照组OCB、脑脊液及血清抗AQP4抗体阳性率的比较

2.2 MS组与对照组 （NND 组＋外科手术组）OCB、脑脊液及血清抗AQP4抗体阳性率的比较 因NND 组与外科手术组各项研究指标的阳性率均无统计学差异，将NND 组与外科手术组合并为对照组，与MS组作进一步对比分析。30例MS组患者中，OCB阳性者14例，脑脊液抗AQP4抗体阳性4例，血清抗AQP4抗体阳性10例；98例对照组患者中，OCB阳性者2例，脑脊液及血清抗AQP4抗体阳性各3例。MS组与对照组比较，OCB及血清抗AQP4抗体阳性率差异有统计学意义（P＜0.01），脑脊液抗AQP4抗体阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

3 讨论

本研究NND 组患者诊断包括中枢神经系统肿瘤、动脉硬化性脑梗死、癫、运动神经元病、线粒体病等，外科手术组患者则均为泌尿系结石、前列腺增生或外伤性骨折等外科手术的患者，NND 组与外科手术组患者均不存在神经系统或其他系统炎性疾病，且NND 组与外科手术组在OCB、脑脊液抗AQP4抗体及血清抗AQP4抗体阳性率上差异均无统计学意义，因此本研究将该2组患者合并为对照组，与MS组进行进一步的对比分析，较能反应MS患者与正常人群在各项研究指标上的差异。同时本研究入组的30例MS患者为临床已经明确诊断的患者，在留取血清及脑脊液标本前均未曾使用过激素及其他免疫抑制类药物，排除了该类药物对患者血清及脑脊液相关指标的影响，提高了研究结果的准确性。

鞘内IgG 抗体的自身合成是MS的重要免疫学异常，脑脊液IgG OCB常作为判定鞘内IgG 自身合成的定性指标。本研究MS组30例患者中有14例OCB 阳性，其阳性率为46.7%。而对照组OCB阳性仅有2例，其中1例为16岁的女性癫患者，癫原因尚不明确，另1例为25岁的女性脑血管疾病患者，其病因不能除外血管炎可能。MS组OCB阳性率较对照组明显偏高，其差异有统计学意义。国内陈红媛等［3］的研究中，21例MS患者的脑脊液OCB 阳性率也达到了47.6%，与本研究结果相近。因为种族差异的原因，西方国家报道MS的OCB阳性率较国内更高，Bourahoui等［4］的研究就显示MS患者的OCB阳性率高达95%。国内外研究均提示MS患者存在特异性抗体鞘内合成，OCB 对于鉴别MS与其他神经系统疾病具有重要意义。

水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是一组具有高度选择性的水跨膜转运蛋白通道家族，目前已被克隆和鉴定出来的水通道蛋白有13种（AQP0～AQP12）。AQP4 是中枢神经系统主要的水通道蛋白，在跨膜水转运、维持血-脑屏障完整性和中枢神经系统内环境稳定性方面发挥重要作用［5］。随着2004年抗AQP4抗体的发现［6］，其相关研究成为近年来神经免疫领域关注的热点。本研究对比观察了30例MS患者脑脊液及血清抗AQP4 抗体的阳性率，MS 组血清抗AQP4抗体阳性率为33.3%，明显高于对照组（3.1%），差异有统计学意义。虽然MS组脑脊液抗AQP4抗体阳性率与对照组比较其差异无统计学意义，但是其13.3%的阳性率仍然明显高于对照组（3.1%）。早期的研究认为抗AQP4抗体是视神经脊髓炎（neuromyelitis optica，NMO）的重要的生物学标记物，NMO 也因此而区别于MS被认为是一种独立的自身免疫性水通道病，并且在2006年修订的NMO 诊断标准［7］中，增加了抗AQP4抗体作为NMO 的诊断支持条件之一。陈瑶等［8］研究的37例MS患者血清抗AQP4抗体检测无1例阳性，但35 例NMO 患者的血清抗AQP4 抗体阳性率就高达88.6%。但是近年来其他的一些研究提示，部分MS患者血清同样也可以出现抗AQP4 抗体的阳性表达。2011年杨扬等［9］的研究中，86 例MS患者血清抗AQP4 抗体的阳性率为4.7%。赵忙所等［10］的研究中，32例MS患者的血清抗AQP4抗体阳性率为9.4%。邵文君等［11］的研究显示MS患者血清抗AQP4抗体阳性率则达到20%。本研究33.3%的MS患者血清抗AQP4抗体阳性率略高于上述其他研究，分析其原因可能与相关药物降低了其他各项研究抗AQP4抗体阳性率有关。有研究［12］显示免疫抑制剂能够降低NMO 患者血清抗AQP4抗体滴度并发挥治疗作用，推测此类药物对于MS 患者也可能发挥相似作用，从而降低MS患者血清或脑脊液抗AQP4 抗体的阳性率。而本研究入组的30例MS患者在行血清及脑脊液标本检测之前均未使用过激素或其他免疫抑制类药物，避免了此类药物对检测结果的影响。由此可见，临床上对于中枢神经系统脱髓鞘疾病的患者，并不能仅凭血清或脑脊液抗AQP4抗体阳性而除外MS的诊断，还需要结合患者的病史、临床体征及影像学表现等各项资料进行综合分析。

总而言之，MS是中枢神经系统脱髓鞘疾病中发病率较高的常见疾病。MS患者具有较高的脑脊液OCB 阳性率及血清抗AQP4抗体阳性率，提示体液免疫在MS的发病过程中也发挥着一定作用。脑脊液OCB阳性对MS辅助诊断具有重要意义。部分MS患者可表现为血清或脑脊液抗AQP4抗体阳性，在诊断方面需要结合患者的病史、临床体征及影像学表现等各项资料进行综合分析，以避免误诊为NMO。

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