尘螨肠道微生物蛋白核苷二磷酸激酶的克隆、表达及纯化

杨小猛，王俊轶，2，陈 涛，刘志刚，3，杨平常，3*

(1.深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所，广东深圳518060;2.泸州医学院附属医院呼吸内科，四川泸州646000;3.深圳市过敏反应与免疫学重点实验室，广东深圳518060)

0 引言

过敏性哮喘是常见的呼吸系统疾病，其发病率和死亡率呈上升趋势［1］.过敏性哮喘具有反复发作的特点，严重影响患者的生活、工作和学习.在众多引起过敏性疾病的吸入性过敏原中，尘螨是导致过敏性哮喘的最重要因素［2-3］.多年来国内外学者对于天然尘螨疫苗免疫治疗作用机制的研究主要集中于尘螨抗原本身［4-5］，既往研究发现尘螨浸出液和尘螨体内含有微生物成分［6］，本实验室前期研究［7-8］也发现标准化天然尘螨疫苗含有微生物蛋白成分，而这些微生物蛋白成分在天然尘螨疫苗特异性免疫治疗机制中有何作用目前尚不清楚.本实验室对美国NIH标准化天然尘螨疫苗进行质谱分析发现其中含有金黄色酿脓葡萄球菌奥里斯亚种n315株的核苷二磷酸激酶(Nucleoside diphosphate kinase，NDP kinase)成分.本研究采用基因工程技术成功表达并纯化出重组NDP kinase，为进一步研究NDP kinase在天然尘螨疫苗免疫治疗中的作用提供了基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和表达载体 大肠埃希菌E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)由呼吸疾病国家重点实验室深圳大学变态反应分室提供，原核表达载体pET28a购于美国GE公司.

1.1.2 试剂 T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ和 EcoRⅠ均购自 Fermentas公司，Ex-Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司，无内毒素质粒大抽提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，其他普通试剂均为分析纯.

1.2 方法

1.2.1 NDP kinase基因合成和PCR扩增 根据GenBank中NDP kinase的基因序列，将其中稀有密码子改造为大肠埃希菌常用密码子并进行二级结构优化，送至上海生工生物工程公司合成NDP kinase基因，合成基因的上下游分别加上BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点与保护碱基.利用PrimerPremier5.0软件设计该基因特异性引物，上游引物为5'-CGGGATCCCGATGGGCGAAAGCGTTG-3'，下 游 引 物 为5'-CGGAATTCCGACGCGCACGCTTCTCG-3'，引物由上海生工生物工程公司合成.以合成的NDP kinase基因为模板进行PCR扩增.PCR反应条件为:94℃预变性3min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，共31个循环;最后72℃延伸10min.电泳检测PCR产物并切胶回收.

1.2.2 原核重组表达载体的构建和鉴定 将上述所得PCR产物与原核表达载体pET28a分别用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，并用T4 DNA连接酶连接pET28a酶切产物与目的基因片段，得到重组表达质粒pET28a-NDP kinase.再将其转化入感受态E.coli DH5α，涂布于含氨苄青霉素的 LB平板，37℃培养后挑取单菌落，PCR扩增行琼脂糖凝胶电泳筛选阳性克隆菌落.

1.2.3 NDP kinase的表达 上述鉴定正确的阳性质粒转化入感受态E.coli BL21(DE3)中，挑选抗氨苄青霉素阳性菌落置于20mL LB液体培养基中，于200 rpm·min-1，37℃条件下摇床过夜培养.然后将其倒入1 L新鲜灭菌的LB液体培养基(含1∶1000氨苄青霉素)中培养，待细菌生长处于对数生长期(OD600=0.4～0.6)，取1mL菌液作为诱导前对照，再加入终浓度为0.5mmol·L-1的诱导剂IPTG，置于30℃摇床诱导表达3.5 h，诱导结束取1mL菌液，分别将诱导前后样品4℃离心弃上清，沉淀各自置于100μL 1×PBS中重悬，分别加入25μL的5×十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上样缓冲液并混匀，煮沸10min，各取10μL上样进行SDS-PAGE分析，检测NDP kinase重组蛋白的表达情况.

1.2.4 NDP kinase蛋白的可溶性分析 取1mL诱导后菌液离心弃掉上清液，沉淀重悬于1×PBS，冰浴超声破碎20min后离心，分别收集沉淀和上清液.沉淀用1mL去离子水清洗后离心弃上清，再重悬于100μL去离子水中.分别取100μL破碎离心得到的上清和重悬于去离子水的沉淀，加入25μL的5×十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)上样缓冲液并混匀，煮沸10min，各取10μL上样检测表达产物的可溶性.

1.2.5 NDP kinase蛋白的纯化 使用镍离子金属螯合亲和层析柱纯化.简易操作步骤如下:将表达菌液4℃离心弃上清，沉淀用NTA-0平衡液(Tris-HCl:2.422 g，NaCl:29.220 g，甘油:100mL，pH 值为8.0)重悬，冰浴超声破碎后4℃高速离心收集上清液.NTA-0平衡液平衡亲和层析柱，1mL·min-1速度上样，上样完毕后用1×PBS洗出杂蛋白，再分别用 20、60、200 和 500mmol·L-1咪唑洗脱层析柱并分管收集各洗脱液样品，进行SDS-PAGE分析.

2 结果

2.1 NDP kinase基因PCR扩增结果

以NDP kinase基因作为模板，使用特异性引物进行PCR得到的产物经琼脂糖凝胶电泳，可见一约490 bp的条带，大小与理论预计值相符结果见图1.

图1 NDP kinase基因的PCR扩增结果

2.2 重组克隆的筛选和鉴定

将双酶切得到的PCR片段与载体pET28a片段连接，构建pET28a-NDP kinase重组质粒并转入大肠埃希菌E.coli DH5α，涂布于含氨苄青霉素的LB平板培养，挑取单个菌落经PCR扩增目的基因筛选单克隆阳性菌结果见图2.

图2 菌落PCR鉴定阳性克隆菌

2.3 NDP kinase的诱导表达和可溶性鉴定

将pET28a-NDP kinase重组质粒转入E.coli BL21(DE3)，扩增培养阳性菌株，加入0.5mmol·L-1IPTG，30℃诱导3.5 h，表达产物经SDS-PAGE电泳分析，结果显示约在21.5 kD处有外源蛋白条带(见图 3)，与理论值相符，其中标签大小为5.0 kD，NDP kinase蛋白约为16.5 kD.表达产物经冰浴超声破碎后，分别收集沉淀和上清进行SDSPAGE电泳分析，结果显示目的蛋白在超声破碎上清和超声破碎沉淀中均有表达，说明目的蛋白既有可溶性表达，也有包涵体形成(见图4).

图3 NDP kinase蛋白的诱导表达结果

图4 NDP kinase蛋白的可溶性鉴定结果

2.4 NDP kinase的纯化

重组NDP kinase带有His标签，可以采用镍离子金属螯合亲和层析柱纯化表达产物，依次使用PBS、20、60、200 和 500mmol·L-1咪唑洗脱并收集目的蛋白后进行SDS-PAGE电泳分析，检测发现500mmol·L-1咪唑洗脱液约在21.5 kD处有单一特异性蛋白条带出现，为纯化的目的蛋白(见图5).

图5 NDP kinase蛋白纯化的SDS-PAGE结果

3 讨论

变态反应性疾病是当今世界性的重大卫生问题，严重危害人类健康.世界各国变态反应性疾病总发病率已达15%～30%，并且全球发病率和死亡率逐年上升［1］.此类疾病主要包括过敏性哮喘、过敏性皮炎和过敏性鼻炎等，特别是过敏性哮喘，目前世界上有近3亿人受哮喘困扰;而我国就有多达3000万余，其中小儿超过1000万人.过敏性疾病已经严重影响了人们的生活质量，严重的过敏性哮喘等病甚至成为潜在的致死性疾病.过敏性哮喘的发生与室内过敏原暴露密切相关，其中尘螨是最常见也是最重要的室内吸入性变应原［9-10］.尘螨是世界性分布的重要变应原，室内主要分布在卧具、沙发、底面及空调滤网等处［11］，其分泌物、排泄物及尸体的降解产物等以粉尘为载体飞扬于空气中，过敏体质者吸入后诱发Ⅰ型变态反应，从而引起哮喘、过敏性鼻炎、异位性皮炎和荨麻疹等多种过敏性疾病.

标准化尘螨疫苗特异性免疫治疗(SIT)是目前惟一能改变过敏性疾病进程的治疗方法，能阻止症状的恶化和防止对新过敏原产生变态反应［12］.随着对过敏性疾病发病机制的进一步认识以及对特异性免疫治疗机制的深入研究，世界卫生组织(WHO)在1998年公布《WHO有关免疫治疗的指导文件》中指出，标准化变应原疫苗特异性免疫治疗是目前针对变态反应性疾病的惟一病因治疗方法，鼓励应用和发展标准化的变应原疫苗.尘螨疫苗主要分为标准化尘螨疫苗和基因工程重组疫苗，目前临床上广泛用于治疗过敏性哮喘的尘螨疫苗主要还是标准化天然疫苗，这是一种天然尘螨变应原的提取液，成分比较复杂，除去尘螨自身变应原以外还存在其他蛋白成分.多年来国内外学者对于天然尘螨疫苗免疫治疗作用机制的研究都集中于尘螨抗原本身［4-5］.既往研究发现尘螨浸出液和尘螨体内含有微生物成分［6］，本实验室前期研究也发现约占尘螨大部分体腔的消化道中存在众多微生物，对标准化天然尘螨疫苗成分分析也显示其中含有微生物蛋白成分，而这些微生物蛋白成分是否在天然尘螨疫苗特异性免疫治疗机制中发挥作用目前却并不清楚.

本实验室在对美国NIH标准化天然尘螨疫苗进行质谱分析过程中，发现疫苗中含有源自源自金黄色酿脓葡萄球菌奥里斯亚种n315株的NDP kinase成分.本研究通过构建pET28a-NDP kinase原核表达载体，实现了其在大肠埃希菌E.coli BL21(DE3)中的高效表达，由于重组目的蛋白带有His标签，因此可以通过镍离子金属螯合亲和层析技术进行纯化.本研究建立了NDP kinase原核表达和纯化方法，为进一步研究其在标准化天然尘螨疫苗特异性免疫治疗机制中的作用奠定了基础.

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