棕榈酰五肽-3裂解条件的单因素实验

王小青，赵红玲，高 杨，王良友，尹志峰

(河北省中药研究与开发重点实验室，承德医学院中药研究所，河北承德 067000)

技术方法

棕榈酰五肽-3裂解条件的单因素实验

王小青，赵红玲，高 杨，王良友，尹志峰

(河北省中药研究与开发重点实验室，承德医学院中药研究所，河北承德 067000)

棕榈酰五肽-3;裂解条件;单因素实验

棕榈酰五肽-3(Matrixyl，氨基酸序列为Pal-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser，缩写为PAL-KTTKS)是棕榈酰寡肽系列抗皱多肽小分子的一种，其抗皱作用的机制为模拟信号肽KTTKS(来源于前胶原蛋白α1链的水解产物)，通过促进Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白和纤维粘连蛋白的生成，增加皮肤厚度及减少细纹[1]。棕榈酰五肽-3是近年来兴起的一种化妆品原料，但高昂的价格限制了其广泛应用[1]。本研究在前期工作的基础上[2]，对棕榈酰五肽-3的合成方法进行了优化，以期提高棕榈酰五肽-3的纯度，为工业化量产提供参考[3-4]。

1 仪器与材料

戴安U3000高效液相色谱仪(UV检测器，美国戴安公司)，Newstyle型反相高效半制备液相色谱仪(苏州汉邦科技有限公司)，戴安液相色谱质谱联用仪Ultimate 3000/ MSQ(美国戴安公司)，CHRIST冻干机(北京博励行仪器有限公司)，高速大容量离心机(上海安亭科学仪器厂)，固相合成载体Wang树脂(天津南开合成科技有限公司，替代度为1.17mmol/g)，CTC树脂(天津南开合成科技有限公司，替代度为1.2mmol/g)肽链中所有保护氨基酸(成都诚诺新技术有限公司)，HOBt与DIC(苏州中科天马肽工程中心有限公司)，冰乙醚与TFA(天津市风船化学试剂科技有限公司)，哌啶、苯甲硫醚、间甲酚与苯甲醚(上海晶纯试剂有限公司)，EDT(Sigma-Aldrich)，DMF(天津市科密欧化学试剂有限公司)。

2 方法

2.1 固相合成载体的选择 采用Fmoc固相多肽合成策略，分别选择Wang树脂与CTC树脂分别按照附图所示的合成路线图合成棕榈酰五肽-3。

附图 棕榈酰五肽-3合成路线图(以Wang树脂为例)

2.2 肽树脂裂解时间的选择 按照表1合成步骤称量干燥至恒重的肽树脂，进行反应。过滤，用少许TFA洗涤树脂，无水冰乙醚沉降，析出白色固体，4000rpm离心4min，弃去上清液，重复2次，真空干燥。

表1 采用不同裂解时间的实验方法

2.3 肽树脂裂解前反应方法的选择 将干燥至恒重的肽树脂置于玻璃烧瓶中，分别按照表2加入裂解液反应。过滤，用少许TFA洗涤树脂，滤液用无水冰乙醚沉降，析出白色固体，4000rpm离心4min，弃去上清液，重复2次，真空干燥。

表2 采用不同裂解前反应实验方法

2.4 肽树脂裂解液倍量的选择 将干燥至恒重的肽树脂置于玻璃烧瓶中，按照表3加入裂解液反应2h。过滤，用少许TFA洗涤树脂，滤液用无水冰乙醚沉降，析出白色固体，4000rpm离心4min，弃去上清液，重复2次，真空干燥。

表3 采用不同裂解液倍量实验方法

2.5 肽树脂裂解体系的选择 将干燥至恒重的肽树脂置于玻璃烧瓶中，加入裂解液反应2h。过滤，用少许TFA洗涤树脂，滤液用无水冰乙醚沉降，析出白色固体，4000rpm离心4min，弃去上清液，重复2次，真空干燥。

表4 采用不同裂解液体系的实验方法

3 结果与讨论

固相合成中固相载体的选择非常关键，它不仅关系到合成速率，对合成目标肽的纯度、收率都有重要影响，CTC树脂增量不明显，且价格较贵，故而固相合成载体选择Wang树脂较好。

固相合成中为了得到纯度更好的多肽，降低多肽纯化得难度，需要对裂解条件进行优化，本研究对肽树脂裂解反应进行了单因素实验，裂解时间为2.5h，0℃反应20min后逐步升高到30℃反应2h，裂解液为12倍于肽树脂，裂解体系选择100% TFA体系裂解后粗肽纯度最高。见表5。

表5 不同裂解条件对粗肽纯度的影响结果

该结果作为多肽裂解的参考，但是在进行工业生产时还应考虑原料的价格以及中试结果对得率的影响。

[1]郭建维,钟星,徐晓健.药妆品胜肽的合成及作用机制研究进展[J].广东工业大学学报,2013,30(3):1-8.

[2]王小青,赵红玲,高杨,等.棕榈酰五肽-3的固相合成[J].承德医学院学报,2013,30(5):414-415.

[3]王德心.活性多肽与药物开发[M].北京:中国医药科技出版社，2011.442-492.

[4]厉保秋.多肽药物研究与开发[M].北京:人民卫生出版社，2008.51-67.

Q78

A

1004-6879(2014)05-0419-02

2014-03-12)