基因芯片技术在脑胶质瘤诊疗中的研究进展

马增翼

（复旦大学附属华山医院 神经外科，上海201907）

胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是起源于神经外胚层的肿瘤，占成人颅内肿瘤的25%，是神经系统最常见的高度恶性肿瘤（WHO IV级），其生存期短，死亡率高，治疗困难［1］。目前，普遍推荐的GBM标准治疗方案是手术后同步放化疗＋6个疗程的替莫唑胺（temozolomide，TMZ）化疗，其平均 生 存 期 仅 12 ～ 15mon［2，3］。EORTC-NCIC（EORTC：欧洲癌症研究治疗组织；NCIC：加拿大国立癌症研究院）随机III期临床试验结果提示：经标准治疗后，GBM 总体平均生存期为14.6mon［4］，结果均不尽人意。由此可见，深入研究GBM发病机制，完善诊疗途径，是现今GBM重要研究方向。

随着人类基因组计划的进展，对胶质母细胞瘤的认识也进入到基因水平，2008年TCGA（The Cancer Genome Atlas，癌症基因图谱）发表的文章分析了GBM的3条关键信号通路［5］，两年后，其又结合临床预后结果等，将GBM分为原神经型、神经型、经典型和间质型等四型［6］。期间大量的基因测序，DNA拷贝分析，基因表达谱筛查都使用了基因芯片技术—通过微加工技术，对成千上万的肿瘤碱基顺序进行自动化，高效率的分析。对GBM的分子表达特征进行综述，旨在为胶质母细胞瘤诊断、治疗以及预后有关的基因通路表达的研究拓展思路。

1 基因芯片简介

1.1 基因芯片技术与原理

基因芯片（genechip）（又称DNA芯片，生物芯片）技术指通过微加工技术，将大量特定序列的基因探针分子固定于支持物上后，与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获得样品分子的数量和序列信息。之后随着探针固相原位技术及照相平版印刷以及激光共聚焦显微技术的引入，使得基因芯片技术以其快速、高效、自动化平行处理等特点，迅速在突变基因检测、基因表达谱筛查、杂交测序等方面展露头角。

基因芯片的原型是二十世纪八十年代中期提出的。基因芯片的测序原理是杂交测序方法：通过与一组已知序列的核酸探针进行杂交，从而进行核酸序列的测定。基因芯片可以分为三种主要类型：① 固定在聚合物基片上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影检测。②用点样法固定在玻璃板上DNA探针阵列，多用于检测DNA的变异。③ 硬质表面直接合成的寡核苷酸探针阵列。基本流程包括：芯片的设计与制备，样品的制备标记，生物分子杂交反应，信号的检测。

1.2 基因芯片特点及在脑胶质瘤中的应用

基因芯片的优点是能够提高效率，减低单个芯片成本，特别适用于大规模的基因信息采集与分析。基因芯片可以同时将大量的核酸探针固定在支持物上，一次性的对大量样品序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印记杂交技术操作复杂、自动化程度低、操作数量少等缺陷［6］。同时，该技术还具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测序、实变检测、多态性分析等。

脑胶质瘤的发生、发展都伴随着复杂的基因表达的改变。通过采用基因芯片技术，可以高效的筛查与肿瘤侵袭力、分级等有关的基因表达异常及通路，了解表现形式和基因水平的内在关联，从而在揭示出新的重要肿瘤相关基因的同时，为进一步基因靶向个体化治疗寻求新的道路。

2 基因芯片在胶质瘤基因分析研究中的应用

2.1 胶质母细胞瘤相关信号通路的研究

TCGA重点分析了3条GBM的核心通路：酪氨酸激酶受体（RTKs）信号，P53信号肽和RB介导的控制细胞周期进展通路。之后，对相关通路的研究进展迅速。在胶质母细胞瘤中，三条重要通路RTK／RAS／PI-3K、P53和 RB信号变化分别为88%、87%和78%，其中74%的异常在三个途径同时存在，暗示着三条路径的异常存在有一个共同的发病机制［5］。Karisa等在TCGA的基础上通过对PTEN，TP53和RB1进行后续研究发现，PTEN、TP53和RB1通路的改变是在人脑胶质瘤发病中肯定要发生的机制。他们通过诱导上述基因失活，发现在PI-3K和RB通路中，Pten或Rb基因的缺失是始发事件［7］。Karisa等通过使用伽马分泌酶抑制剂（MRK-003）抑制肿瘤细胞生长等方式，研究了GBM的NotchHedgehog，和 Wnt三个通路，也得出相似的结论：尽管抑制了Notch通路，并且伴随有Wnt和Hedgehog通路的正向活化，GBM对长期的MRK-003治疗仍有部分耐药［8］，且各通路之间的关系还有待研究。深入了解已知各通路的相互联系和对GBM发病机制的影响将会是重要研究方向。

2.2 胶质母细胞瘤差异性基因表达的研究

在胶质母细胞瘤中，染色体7的扩增和染色体10的缺失是高频发生的。典型的亚型除此之外还有EGFR的扩增且缺失TP53的突变。原神经亚型多有高富集的少突胶质细胞标记。此外，典型的亚型和鼠的星形细胞有很强的正相关。神经亚型则显示出一个少突胶质细胞和星形细胞的区别，而且富集了神经元的基因差别表达。间质亚型则与星型胶质细胞培养标签紧密关联［9］。对于NF1基因的研究表明，尽管在人脑胶质瘤中，NF1基因的突变只是一个小的系列［9］，但在206例患者样品中，至少47例存在NF1基因的失活或者缺失［5］。同时，Morante等人研究发现，减少CCAAT／增强子结合蛋白（C／E）b的表达可以抑制胶质母细胞瘤细胞的生长。C／E是一种和代谢、生长发育、细胞分化和增殖相关的亮氨酸拉链转录因子。减少其表达，可以让GBM细胞停留在细胞周期的G0／G1的边界，并减少了它们的转化和迁移能力［10］。

2.3 胶质母细胞瘤分型后的个体化治疗前景

通过用分子和基因组技术对胶质母细胞瘤分型的最大优势不仅在于可以对每个肿瘤患者进行有针对性的个体化治疗，同时可以帮助患者降低用药风险。在多元化辅助治疗的今天，根据亚型的不同，有针对性的为患者选择放化疗、免疫治疗或者靶向治疗提供非常坚实的理论基础。有12%的胶质母细胞瘤和70%的神经胶质瘤存在IDH1突变。2009年，马萨诸塞州剑桥Agios药物制剂公司的科学家报道，突变的IDH1酶促进产生了 （R）-2-hydroxyglutarate，一种和中枢神经系统癌症相关联的代谢产物。这些科学家们正在寻找药物抑制这种变异酶的活性［11］。其结果奠定了在生物医学领域个性化治疗的基础，同时也为胶质母细胞瘤亚型异种移植模型的建立提供支持。神经胶质瘤细胞逃避免疫系统的能力是一个阻碍免疫治疗成功的重大障碍。Waldron等［12］报道，PTEN癌抑制基因缺失，联合活化PI3K／Akt／mTOR通路，导致人神经胶质瘤表型诱导的T细胞自动凋亡，说明PTEN基因缺失的患者不适合联合T细胞免疫治疗。

目前，最大的辅助治疗定义为同时放化疗，或超过3个后续周期的化疗。在注册的临床试验（http：／／clinicaltrials.gov／）中，Temozolomide（TMZ）被认为是标准的治疗方案，其中针对GBM的就有208项试验。但是根据TCGA的分型研究，典型亚型和间质亚型的患者经过上述治疗明显降低死亡率，但是对于神经亚型只存在降低死亡率的趋势，而对于原神经亚型没有证据证明可以增加生存状态［13］。一些专家以此为基础，完成了对整个基因组的甲基化综合分析，同时完成了基因表达文库后发现，并不是每个患者都需要常规的手术及放疗和替莫唑胺化疗，MGMT甲基化的肿瘤患者，如果其TBX3，DGKI，和FSD1启动子在甲基化的状态，则不存在使用替莫唑胺化疗的价值，而不建议使用［14］。根据Verhaak等的经典分型，间质亚型的GBMs对放疗更加敏感，而经典的GBMs对一线化疗反应更好［9］，Ducray等［15］发现，如果患者的P16缺失，那么无论其 MGMT启动子的甲基化情况如何，其辅助化疗效果都是明显的，如果P16基因存在，那么辅助化疗只有对MGMT启动子甲基化的患者有效果。

基因芯片已经广泛用于人体肿瘤分析，其高效率、大信息量等特点远远优越于传统的基因分析法。通过基因芯片筛查胶质母细胞瘤的差异性表达基因，可以深入探讨发病机制，还可以针对肿瘤分型进行靶向个体化治疗。通过基因芯片和临床的紧密结合，在不远的将来，攻克胶质母细胞瘤会成为现实。

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