相同遗传背景结直肠腺瘤-癌组织序列CHOP表达与细胞增殖/凋亡比率的研究*

李伊倩, 陈俊榕, 李初俊△, 赵睿颖, 杨惠玲, 朱颖钰, 蔡清红, 胡思源

(1中山大学附属第六医院，广东 广州 510655； 2哥伦比亚大学生物科学系, 美国 纽约 10027；3中山大学中山医学院病理生理教研室，广东 广州 510080)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是消化道常见的恶性肿瘤，2012年中国肿瘤登记年报显示结直肠癌的发病率居全国恶性肿瘤的第3位，死亡率居第5位。腺瘤-腺癌恶变途径[1]是目前公认的CRC发生最重要的途径,2/3以上的CRC由腺瘤进展而来，腺瘤越大、形态越不规则、绒毛含量越高、上皮异型增生程度越重，癌变机会越大[2]。但目前其癌变途径和分子机制尚不明确，结直肠癌的早期筛查工作开展困难，超过一半的患者在确诊时肿瘤细胞已经发生转移，因此研究腺瘤癌变机制，为结直肠癌的早发现、早诊断和早治疗提供新方法至关重要。

内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是目前国内外关于细胞增殖、分化与肿瘤发生、发展、治疗及预后等相关领域的研究热点。C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)为内质网应激的关键分子标志物，被认为是内质网应激时使细胞程序性凋亡的一种重要的内质网应激相关蛋白[3]，CHOP的促癌作用可能机制为其选择性促进细胞凋亡，并进一步启动细胞再生[3]。细胞的增殖和凋亡失衡与肿瘤的发生、发展密切相关。正常生理状况下，结直肠黏膜上皮细胞不断更新，增殖和凋亡处于相对平衡状态，从而保证机体结构和功能正常。一旦增殖和凋亡失衡，将会影响细胞的数量和质量甚至导致结直肠肿瘤的发生和发展。本课题组陈俊榕等[4]已通过检测多例不同遗传背景条件下结直肠腺瘤及腺癌组织中CHOP蛋白表达及细胞凋亡水平，结果表明CHOP及细胞凋亡可能参与结直肠腺瘤癌变过程。CHOP蛋白可以促进肿瘤的发生发展与其促进肿瘤细胞的凋亡两者似乎矛盾。但是我们猜想CHOP在促凋亡的同时，可能也会诱发其靶基因TRB3(Tribbles homolog 3)的反馈调节[5]，及受其它多种促生存调节信号的影响，从而促进细胞生存，最终使细胞增殖和凋亡失衡，肿瘤细胞失控性生长，导致肿瘤发生发展。因此，深入研究结直肠腺瘤癌变不同阶段组织中细胞增殖和凋亡的关系及其调节机制，对了解结直肠癌的生物学行为及发病机制有重要的意义。本研究检测具有相同遗传背景的多组伴低级别上皮内瘤变腺瘤、伴高级别上皮内瘤变腺瘤、腺癌手术切除标本及对应正常肠黏膜中CHOP表达水平、细胞增殖指数(proliferative index,PI；即Ki-67阳性细胞率)和细胞凋亡指数(apoptotic index,AI)，首次研究相同遗传背景下结直肠腺瘤-癌组织序列CHOP、细胞增殖/凋亡比率(proliferative/apoptotic ratio,PAR)的变化及两者之间的关系，从ERS角度及细胞增殖及凋亡失衡角度阐明结直肠腺瘤癌变机制，寻找CRC早发现、早诊断和早治疗的新方法。

材 料 和 方 法

1 材料

收集中山大学附属第六医院2009年1月1日至2013年1月1日行电子结肠镜下及手术切除的23例病人的伴低级别上皮内瘤变腺瘤(伴轻、中度异型增生的腺癌)、伴高级别上皮内瘤变腺瘤(包括伴重度异型增生的腺瘤、原位癌和黏膜内癌)和腺癌石蜡切片标本，及每一例病人的癌旁正常肠黏膜(指结直肠癌手术切除标本最远端的肠黏膜组织，病理确证无癌细胞浸润)。其中女性10例，男性13例；年龄35～78岁，平均年龄63.5岁；直肠癌16例，结肠癌7例；按照肠癌Dukes分期标准，Dukes A期5例，Dukes B期9例，Dukes C期8例，Dukes D期1例；按照WHO新分类标准[6]高分化腺癌9例，中分化腺癌12例，低分化腺癌2例。所有组织标本均经10%甲醛固定、脱水并常规石蜡包埋；4 μm连续切片，贴在经Poly-Lysine防脱片处理的防脱载玻片上，置60 ℃烤箱烘烤90 min备用；所有切片标本均经HE染色病理确证。已排除术前行放疗及化疗者、家族性腺瘤性息肉病患者。

2 方法

2.1免疫组化SABC法 CHOP多克隆兔Ⅰ抗(F-168)及Ki-67单克隆鼠Ⅰ抗均购自Santa Cruz；SABC免疫组化染色试剂盒(含5%BSA封闭液，兔Ⅱ抗或鼠Ⅱ抗，SABC反应液：链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物)购自武汉博士德生物工程有限公司；二氨基联苯胺(diaminobenizidine, DAB)显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。主要实验步骤如下：(1)烤片，常规脱蜡及水合；(2)消除内源性过氧化物酶：置于3%过氧化氢溶液中反应15 min，蒸馏水洗5 min×3次；(3)微波修复抗原：玻片浸泡于0.01 mol/L枸橼酸盐溶液，置于微波炉中微波3 min×4次，并自然冷却至室温，蒸馏水洗5 min×3次，免疫组化画圈笔在组织块周围画圈，PBS洗5 min×3次；(4)血清封闭：5%BSA封闭20 min，甩干；(5)Ⅰ抗孵育：Ⅰ抗稀释液将Ⅰ抗稀释至适当比例(CHOP 1∶50，Ki-67 1∶50)，滴至组织上将组织覆盖，置于4 ℃冰箱中过夜，并复温20 min，PBS洗5 min×3次；(6)孵育Ⅱ抗；分别滴加兔Ⅱ抗及鼠Ⅱ抗常温反应30 min, PBS洗5 min×3次；(7)SABC级联反应：滴加SABC反应液常温反应30 min, PBS洗5 min×3次；(8)DAB染色3～5 min, PBS洗5 min×3次；(9)苏木素复染20 s,自来水冲洗；(10)1%盐酸乙醇分化3 s；(11)脱水及透明；(12)常温自然风干、中性树胶封片、盖片；(13)光学显微镜观察。

2.2TUNEL法 根据南京凯基TUNEL凋亡细胞检测试剂盒(FITC标记法)说明书进行检测。具体步骤如下：(1)60 ℃烤片1 h，脱蜡及水合；(2)1%Triton X-100 通透液通透5 min；(3)滴加蛋白酶K于 37 ℃反应30 min，PBS漂洗10 min；(4)3%H2O2常温封闭10 min，以阻断其内源酶，PBS漂洗10 min；(5)滴加TdT酶反应液，加盖玻片37 ℃湿润避光反应60 min，PBS漂洗15 min；(6)滴加链霉亲和素-FITC标记工作液，加盖玻片37 ℃避光湿润反应60 min，PBS漂洗30 min；(7)荧光显微镜观察：激发波长450～500 nm，发射波长515～565 nm。

3 结果判读

3.1CHOP及Ki-67表达结果 采用双盲法显微镜观察并计数。用已知CHOP阳性乳腺癌组织及Ki-67阳性扁桃腺细胞免疫组化结果作为阳性对照，不滴加Ⅰ抗的肠癌组织作为阴性对照。可见CHOP蛋白表达于细胞质和细胞核中，呈棕黄色；Ki-67全部表达于细胞核中，呈棕褐色。根据DAB染色结果，参照Ishida[7]判定标准进行结果判定：随机选取5个细胞富集、染色均匀的200倍视野，分别对染色阳性细胞及阴性细胞进行计数，5个视野阳性细胞百分率的平均值作为阳性细胞百分率，Ki-67阳性细胞百分率为PI。

3.2TUNEL法检测凋亡结果 采用双盲法显微镜观察并计数。用DNA酶处理的肠黏膜组织作为阳性对照，不滴加TdT酶的肠癌组织作为阴性对照。荧光显微镜可见凋亡阳性的细胞激发出绿色荧光。连续观察5个200倍视野, 5个视野阳性细胞百分率的平均值即AI[7]。

4 统计学处理

采用SPSS 16.0，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，利用随机区组设计的方差分析及Bonferroni多重比较方法，利用定量资料的关联分析方法分析CHOP表达水平和PAR之间的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 相同遗传背景结直肠腺瘤-癌组织序列CHOP蛋白表达

肠癌标本PBS代替Ⅰ抗者呈阴性表现，正常肠黏膜CHOP蛋白少量表达于细胞核和细胞浆，腺瘤和腺癌组织CHOP表达明显增加，分布于细胞核和细胞浆，见图1。正常肠黏膜、伴低级别上皮内瘤变腺瘤、伴高级别上皮内瘤变腺瘤及腺癌CHOP表达阳性细胞百分率，见表1；相同遗传背景腺瘤癌变序列组织中CHOP阳性细胞百分率差异比较有统计学意义(P<0.01)。CHOP在结直肠腺癌组织中的阳性细胞率显著高于伴高级别上皮内瘤变腺瘤、伴低级别上皮内瘤变腺瘤和正常肠黏膜(P<0.01)；伴高级别上皮内瘤变腺瘤中的阳性细胞率显著高于伴低级别上皮内瘤变腺瘤和正常肠黏膜(P<0.01)，伴低级别上皮内瘤变腺瘤中的阳性细胞率显著高于正常肠黏膜(P<0.01)。

Figure 1. CHOP expression detected by immunohistochemistry SABC method.A: HE staining(×200); B: negative control (×400); C:normal mucosa (×200); D: adenoma with low-grade intraepithelial neoplasia (×200); E: adenoma with high-grade intraepithelial neoplasia (×200); F:colorectal adenocarcinoma (×200); G: colorectal adenocarcinoma (×400).

2 相同遗传背景结直肠腺瘤-癌组织序列增殖与凋亡比率PAR表达差异分析

肠癌标本PBS代替Ⅰ抗者呈阴性表现，正常肠黏膜Ki-67少量表达于细胞核，腺瘤和腺癌组织Ki-67表达明显增加，分布于细胞核，见图2。用DNA酶处理的正常肠黏膜组织呈明显阳性表现，不滴加TdT酶的肠癌组织呈阴性表现。荧光显微镜可见凋亡阳性的细胞激发出绿色荧光，分布于细胞核，见图3。正常肠黏膜、伴低级别上皮内瘤变腺瘤、伴高级别上皮内瘤变的腺瘤及腺癌PI、AI和PAR见表1；相同遗传背景腺瘤癌变序列组织PAR差异比较有统计学意义(P<0.01)。PAR在结直肠腺癌组织显著高于伴高级别上皮内瘤变腺瘤(P<0.01)、伴低级别上皮内瘤变腺瘤和正常肠黏膜(P<0.01)；伴高级别上皮内瘤变腺瘤显著高于伴低级别上皮内瘤变腺瘤和正常肠黏膜(P<0.01)，伴低级别上皮内瘤变腺瘤显著高于正常肠黏膜(P<0.01)。

3 相同遗传背景结直肠腺瘤-癌组织序列CHOP蛋白表达及PAR关系分析

CHOP蛋白表达和PAR关联性分析结果显示，在伴低级别上皮内瘤变中CHOP蛋白表达水平和PAR的Pearson相关系数r=0.641(P<0.01)；在高级别上皮内瘤变中两者Pearson相关系数r=0.867(P<0.01)；在腺癌组织中两者Pearson相关系数r=0.930，P<0.01；所以可以认为CHOP蛋白表达水平和PAR在结直肠腺瘤-癌组织序列变化过程中呈正相关关系。

讨 论

内质网是真核细胞生物的一种重要的细胞器，是蛋白质合成、折叠和运输以及细胞内Ca2+储存的主要场所。缺氧、糖剥夺及钙离子稳态失衡等[8-9]多种病理因素造成未折叠或者异常折叠蛋白在内质网大量堆积，从而导致ERS。细胞通过启动未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)，降低蛋白合成速度，恢复细胞内环境稳态，从而维持细胞的正常功能。但如果应激过于强烈、持久，内环境紊乱无法纠正，内质网稳态不能及时恢复，则相应凋亡机制被激活以诱导细胞凋亡[10]。内质网应激介导凋亡的通路主要包括caspase-12的活化通路、IRE1-JNK信号通路、促凋亡编码基因CHOP通路。CHOP通路是内质网应激介导凋亡的一个重要的通路。CHOP属于C/EBP转录因子家族成员，也叫生长抑制及DNA损伤诱导蛋白153(growth arrest and DNA damage-inducible protein 153，GADD153)或DNA损伤诱导转录本3(DNA damage-inducible transcript 3， DDIT3)，与各种细胞活动(如增殖、分化、凋亡及能量代谢)相关。正常情况下，CHOP表达水平普遍低下，当发生内质网应激时，内质网应激通路相关蛋白PERK和ATF6的活化均可促进CHOP的表达显著增加[11]，从而促进细胞凋亡。CHOP已被证实与多种非肿瘤性疾病如子痫、阿尔茨海默病和脑缺血发病相关，同时其也与多种肿瘤性疾病如子宫内膜癌[12]、黏液样脂肪肉瘤[13-14]和肝癌[15]的发生发展密切相关。目前关于CHOP与结直肠癌关系方面的研究很少，Rask等[16]研究发现CHOP在结肠癌组织中表达升高，与肿瘤的侵袭性相关。陈俊榕等[4]通过检测多例结直肠腺瘤及腺癌组织中CHOP蛋白表达水平，结果表明CHOP可能参与结直肠腺瘤癌变过程[4]。本实验通过研究相同遗传背景条件下，正常肠黏膜-伴低级别上皮内瘤变腺瘤-伴高级别上皮内瘤变-肠癌序列癌变组织中CHOP蛋白的表达水平，发现随着腺瘤癌变的进展，CHOP表达水平逐渐升高，说明了CHOP可能参与了结直肠腺瘤癌变过程，使其成为具有潜在应用价值的结直肠癌标志物和结直肠癌治疗的新靶点。

Figure 2. Ki-67 expression detected by immunohistochemistry SABC methods.A: HE staining(×200); B: negative control (×400); C:normal mucosa (×200); D: adenoma with low-grade intraepithelial neoplasia (×200); E: adenoma with high-grade intraepithelial neoplasia (×200); F:colorectal adenocarcinoma (×200); G: colorectal adenocarcinoma (×400).

癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活使机体细胞的增殖和凋亡失衡，从而导致肿瘤发生和发展。已有研究证明增殖和凋亡相关蛋白如p53、Bcl-2、COX-2、β-catenin、APC、survivin、Bax、EGFR及IGF-1等可以影响肿瘤的发生发展[17]、放化疗敏感性[18]及复发风险性[19]。对于增殖、凋亡和结直肠肿瘤生物学行为之间的关系，目前国内外研究结果尚未达成一致的观点。Kubbuutat等[20]认为Ki-67抗原在结直肠癌中的表达水平与肿瘤大小、转移情况及预后呈正相关，其可作为判断结直肠癌预后的参考指标。Anjomshoaa等[21]研究了73例原发结直肠癌和27例肝转移癌的Ki-67的表达，结果表明低增殖率是结直肠癌转移病灶和其原发病灶的生物学特征。Kikuchi等[22]检测了结直肠腺瘤癌变组织及腺癌组织中Ki-67表达及凋亡指数，结果表明随着结直肠腺瘤癌变进展Ki-67增殖指数升高，而凋亡指数下降。本实验通过研究同一个体、相同遗传背景下的腺瘤-腺癌转变过程中增殖和凋亡情况的变化，发现随着腺瘤癌变进展，PAR逐渐升高。与Kikuchi等[22]的结果一致。进一步说明腺瘤恶变过程中，细胞增殖及凋亡失衡，细胞失控性生长，导致瘤体积增大呈膨胀性生长，此过程可能参与了结直肠腺瘤的癌变。

表1 结直肠腺瘤癌变不同阶段组织CHOP表达水平、PI、AI及PAR

*P<0.05vsnormal mucosa;#P<0.05vsadenoma with low-grade intraepithelial neoplasia;†P<0.05vsadenoma with high-grade intraepithelial neoplasia.

肿瘤的增殖或者凋亡，反映的只是肿瘤细胞动力学的一个相对独立指标，不能完全反应肿瘤的生物学行为，因此研究结直肠癌变过程中增殖和凋亡的比率，并结合具体信号通路过程更能说明结直肠腺瘤癌变的发病机制。如Aotake等[23]检测了腺瘤癌变序列组织中细胞凋亡指数、Ki-67增殖指数以及反映细胞缺氧程度的微血管密度，从血管生成及细胞增殖、凋亡失衡角度说明增殖增加、凋亡减少及缺氧同时参与结直肠腺瘤癌变过程；Valcz等[24]人通过检测13例正常肠黏膜、伴低级别上皮内瘤变腺瘤、伴高级别上皮内瘤变腺瘤及腺癌中骨桥蛋白(osteopontin，OPN)表达及PAR，结果表明结直肠腺瘤癌变序列组织中OPN及PAR逐渐升高，从OPN及细胞增殖、凋亡失衡方面说明了结直肠腺瘤癌变的可能机制 。本实验从内质网应激角度探讨结直肠腺瘤癌变机制，表明随着腺瘤恶变程度的加深，增殖/凋亡比率逐渐升高。提示内质网应激通路在结直肠腺瘤癌变进展过程中除了发挥细胞凋亡的作用外，可能会通过其它途径如诱发其靶基因TRB3的反馈调节[5]，从而促进细胞生存，调节细胞增殖、生长，改变肿瘤细胞增殖与凋亡的平衡状态，使细胞失控性生长，从而促进肿瘤恶变。同时，结直肠腺瘤在癌变过程中细胞增殖/凋亡比率逐渐升高，细胞失控性生长，组织呈膨胀性生长且生长速度加快，可能造成缺氧、糖剥夺等内质网应激状态，使内质网应激程度进一步加深，从而导致内质网应激主要蛋白CHOP升高。但具体的机制及确切通路尚需进一步研究

总之，本实验首次研究相同遗传背景结直肠腺瘤-癌组织序列中CHOP表达水平、PAR以及两者之间的关系。本研究结果表明相同遗传背景结直肠腺瘤-癌组织序列中CHOP蛋白表达和细胞增殖/凋亡比率逐渐升高，提示CHOP和细胞增殖及凋亡异常可能共同参与结直肠腺瘤癌变过程，为下一步研究内质网应激与结直肠腺瘤癌变关系奠定基础。

[参 考 文 献]

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