姜黄素对阿尔茨海默病大鼠学习记忆及HMGB1和JNK表达的影响*

叶莉莎, 韩 园, 刘启星, 张占琴, 梅虹霞, 曹 红, 连庆泉, 李 军

(温州医科大学附属第二医院麻醉科，浙江 温州 325027)

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)又称老年性痴呆，是以进行性痴呆为主要临床表现的大脑变性疾病。海马和学习记忆密切相关，AD发病时海马往往最先受累。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)作为一应激活化蛋白激酶，各种胞外刺激后其在AD的脑内表达增强。高迁移率族框蛋白1(high mobility group box protien 1，HMGBl)是一种核因子和DNA结合蛋白，在炎症和非炎症性刺激时便大量合成和释放到胞外，加速脑疾病的进程[1-2]。已发现AD患者脑内HMGB1表达升高，可加重认知功能障碍及记忆力减退[3]。姜黄素作为一种多元酚，具有抗氧化、抗炎和亲脂活性，已被用于AD和其它慢性疾病的治疗。本实验旨在探讨姜黄素对AD大鼠学习记忆能力、海马HMGB1、JNK表达的影响，为姜黄素的临床应用提供实验基础。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1动物与分组 清洁级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只，体重250～270 g，由温州医学院实验动物中心提供。实验动物于实验开始前1周，饲养于昼夜节律 12/12 h(8Am～8Pm)通风良好的动物房，室温控制在(22±2)℃，相对湿度50%～70%。采用随机数字表法将其随机分为空白对照组(A组)、模型组(B组)、姜黄素治疗组(C组)和玉米油溶剂对照组(D组)，每组9只。

1.2试剂和仪器 鹅膏蕈氨酸(ibotenic acid,IBO)、姜黄素和玉米油(Sigma)；兔抗SAPK/JNK单克隆抗体(Cell Signaling Technology)；兔抗HMGB1 单克隆抗体(Abcam)；兔抗GAPDH抗体和兔超敏二步法检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。大鼠标准型脑立体定位仪(深圳瑞沃德公司)，Morris 水迷宫分析系统(北京硕林苑科技公司)。

2 方法

2.1AD模型制备及分组处理 大鼠腹腔注射5%水合氯醛7 mL/kg麻醉，头部依靠两耳杆和切牙钩3点固定，根据大脑立体定位图谱，计算出基底核前后向(AP)、左右侧(L)、垂直轴(V)3个方向的坐标(前囟后1.0 mm、中线旁2.6 mm、硬脊膜下7.8 mm)[4]。用2 mL注射器的针头在靶点上钻孔，微量注射器对准靶点，缓慢进针至颅骨下7.8 mm处注入IBO 8 μg，注射时间持续5 min并留针5 min，缓慢退针。术后缝合皮肤并肌注青霉素2×105U预防感染，置于保温毯至清醒。造模24 h后，A组和B组大鼠不给予任何药物，C组大鼠连续腹腔注射100 mg/kg 姜黄素6 d，D组大鼠连续腹腔注射4 mL/kg玉米油6 d。各组大鼠常规饲养。

2.2行为学测试 术后第7天开始为期7 d的Morris水迷宫定位航行实验。实验第1天让大鼠熟悉水迷宫环境，将其放入撤除平台的池中游泳60 s。从第2天进行正式实验，以4个象限轮流作为入水点，将大鼠头部背向平台贴壁入水，记录找到平台的时间，即逃避潜伏期，设定120 s为最长逃避潜伏期。如果大鼠首次未搜索到平台，将其引至平台上停留30 s，引导学习记忆，这时潜伏期记为120 s，之后开始下一象限实验。若首次找到平台，亦放置30 s。记录4次潜伏期的均数即平均逃避潜伏期(average escape latency，AEL)进行统计分析以判断大鼠的学习记忆能力。

2.3免疫组化检测 行为学实验测试结束后，开胸经左心室插管至主动脉，分别灌注4 ℃生理盐水和4%多聚甲醛各200 mL。断头取海马并固定于4%多聚甲醛中，石蜡包埋。切片，片厚4 μm。切片置二甲苯、乙醇梯度脱蜡， PBS 冲洗2次，每次3 min，0.01 mol /L 枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0) 中高压修复，自然冷却至室温，PBS 冲洗2次，每次3 min；3% H2O2室温10 min；兔抗HMGB1抗体(1∶750)4 ℃孵育过夜，加聚合物增强剂，室温孵育20 min；加酶标抗兔聚合物，室温孵育20 min； DAB 显色，苏木精复染，封片。取每只大鼠海马区脑切片6张(部位相同)，观察光镜(×400)下海马组织 CA1、CA3 区图像，利用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件对CA1和 CA3 区HMGB1行半定量分析，计算每组36张切片上HMGB1的积分吸光度值(integrated value,IA)。

2.4Western blotting检测 取新鲜海马组织，-70 ℃保存。行免疫印迹检测时，从低温冰箱中取出海马组织。按15 μL上样总体积30 μg蛋白配置，加上样缓冲液后变性。上样后，样品在浓缩胶内的电压为60 V、分离胶为100 V进行电泳，溴酚蓝接近凝胶底部时停止电泳。300 mA电流湿转1 h。5%脱脂奶粉常温封闭1.5 h。兔抗HMGB1抗体稀释度为1∶10 000，兔抗SAPK/JNK抗体稀释度为1∶1 000，兔抗GAPDH抗体稀释度为1∶2 000，将目的蛋白放置在相应的抗体中4 ℃过夜。辣根过氧化酶标记的山羊抗兔II抗(HMGB1对应的II抗稀释为1∶2 000，JNK和GAPDH对应的II抗稀释为1∶10 000)室温孵育1 h。ECL显影，采用AlphaEase FC凝胶图像分析软件进行曝光和半定量分析，将目的蛋白/GAPDH的灰度值作为目的蛋白表达的相对强度。

3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件分析。数据用均数±标准差(mean±SD)表示，水迷宫潜伏期数据采用重复测量方差分析，免疫组化和Western blotting数据进行正态性检验，多组样本均数比较行方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析，方差齐者采用LSD法，方差不齐者采用Tamhane’s T2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 行为学测试

定位航行实验中，与A组大鼠相比，B和D组大鼠各时点AEL明显延长(P<0.05)，C组大鼠第5天和第6天 AEL明显短于B组(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠Morris水迷宫实验AEL的比较

2 免疫组化

A、C组大鼠海马CA1区及CA3区HMGB1阳性细胞较少，B、D组HMGB1阳性表达增多，且大多数位于胞浆及胞外。IA比较发现，B组和D组CA1区及CA3区HMGB1释放量明显多于A组(P<0.05)，而2组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；C组CA1区及CA3区HMGB1释放量与A组比较差异无统计学意义(P>0.05)，但均明显低于B组和D组(P<0.05)，见图1、2和表2。

Figure 1. Expression of HMGB1 in hippocampal CA1 region in each group(immunohistochemical staining, ×400).A: blank control group; B: model group; C: curcumin treatment group; D: solvent control group.

Figure 2. Expression of HMGB1 in hippocampal CA3 region in each group(immunohistochemical staining, ×400).A: blank control group; B: model group; C: curcumin treatment group; D: solvent control group.

表2 4组大鼠海马各区HMGB1积分吸光度的比较

3 Western blotting

4组大鼠海马HMGB1表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，但B组和D组JNK表达水平明显高于A组，C组JNK表达水平与A组相近，均明显低于B组和D组(P<0.05)，见图3。

Figure 3. Expression of HMGB1 and JNK proteins in each group.A: blank control group; B: model group; C: curcumin treatment group; D: solvent control group. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs group A；#P<0.05 vs group B.

讨 论

AD主要表现为认知功能障碍和记忆损害，因此实验中均以记忆功能下降作为AD动物模型建立的标准，以记忆能力改善作为判断药物有效性的条件之一。基底前脑胆碱能神经元、海马和大脑皮质为胆碱酯酶传递和学习记忆能力的主要位点，将兴奋性氨基酸IBO注入 Meynert基底核，通过谷氨酸受体特异激动胆碱能神经元引起神经元损伤，信号通路随之调节异常，学习记忆状况变差[5]。

流行病学调查显示印度AD患者较美国低4～5倍[6]，推测原因与印度人常食用含有姜黄素成分的物质(如咖喱)有关。研究表明，姜黄素对炎症相关性神经退行性疾病具有保护作用[7]。本实验采用腹腔注射姜黄素对AD大鼠进行干预，发现姜黄素能够改善AD大鼠的学习记忆能力，但其防治AD的机制尚不清楚。本研究之所以选择Morris 水迷宫测试作为行为学检测的方法是因为研究发现它比其它设备(T迷宫、八臂迷宫等)的设计更为合理[8]。

HMGB1是一种核因子和DNA结合蛋白，当体内内环境处于稳态的状态下，以不同的水平存在于大多数细胞核，脑内主要集中于大脑皮质、海马、尾状核等处，表达于神经元和星形胶质细胞，起到稳定核小体、参与DNA重组和修复、调节基因转录和细胞分化等作用[9-10]，但当炎症和非炎症刺激时，HMGB1便大量合成和释放到胞外，作为一重要的晚期炎症因子而加速疾病的进程[3]。HMGB1 可维持和延长炎症, 还是决定细胞选择凋亡或坏死的一个关键信号[11]。尽管目前机制尚不是十分明确，但衰老绝对是包括AD在内的许多神经退行性病变的风险因素。近来发现HMGB1在AD发病中起到了促进作用，随着年龄增加，HMGB1在大脑不同区域的表达水平有所改变，神经元中 HMGB1的胞外释放增加，且此时神经元中 DNA双链断裂明显增加[12]。本研究组前期研究发现姜黄素能抑制全脑缺血再灌注大鼠海马HMGB1的合成与释放，减轻再灌注损伤而起到脑保护作用[13]。本研究试图进一步探索姜黄素能否通过抑制 HMGB1的表达而对 AD起到有益作用，评估 HMGB1在 IBO诱导AD大鼠中的作用，结果发现AD模型组大鼠 CA1和 CA3区海马神经元锥体细胞大量减少，大量 HMGB1释放到胞浆及胞外，而 姜黄素C组大鼠胞浆、胞外释放减少，证实姜黄素可以抑制HMGB1胞浆、胞外释放的作用。

JNK为保守的苏氨酸、丝氨酸蛋白激酶，作为重要的信号转导分子参与细胞的适应、增殖和老化；JNK 通路的激活可增加大鼠脑缺血再灌注后海马神经元caspase-3 的表达，促进海马神经元凋亡[14]。若抑制JNK的表达，可减少凋亡发生，改善大鼠的学习记忆能力[15]。本实验 A和 C组大鼠海马 JNK表达减少，AEL缩短，学习记忆能力增强；而B和D组大鼠JNK表达增高，AEL则明显延长，学习记忆能力能力得到毁损。 姜黄素可抑制JNK的表达，说明AD的发病可能和JNK通路有关。姜黄素能够减少 HMGB1的胞浆、胞外释放，然而海马区 HMGB1的蛋白含量检测并未明显变化，提示AD大鼠大脑损伤主要和胞浆、胞外释放的 HMGB1有关。

总之，姜黄素能够改善AD大鼠的学习记忆能力，其机制可能与抑制HMGB1的胞浆、胞外释放及JNK的表达下调有关。

[参 考 文 献]

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