感觉神经保护延缓失神经性肌萎缩的实验研究

王斌，陈月，杨焕友，张姚

(1.唐山市第二医院手一科，河北 唐山 063000；2.邯郸市中心医院骨科，河北 邯郸 056300)

实验研究

感觉神经保护延缓失神经性肌萎缩的实验研究

王斌1，陈月2，杨焕友1，张姚1

(1.唐山市第二医院手一科，河北唐山063000；2.邯郸市中心医院骨科，河北邯郸056300)

目的研究感觉神经延缓失神经肌萎缩的作用。方法成年雄性SD大鼠40只，随机分成两组，实验组(n=20)即感觉神经移植保护组，对照组(n=20)即纯失神经组。第一阶段：对照组仅横断肌皮神经。实验组完成近端锁骨上神经和远端肌皮神经吻合。第二阶段：第一阶段术后6个月，实验组及对照组完成胸小肌运动神经分支与肌皮神经远端的吻合。第二阶段术后4周及8周内，分别测定大鼠理毛实验、运动单位电位、肌肉湿重、肌肉HE染色、运动终板染色计数等。结果实验组术后第4及8周运动单位电位波幅明显高于对照组，电流刺激敏感度明显优于对照组。二头肌湿重恢复率、肌纤维直径、肌纤维截面积恢复率、运动终板数明显优于对照组。理毛实验于术后第2周时优势明显。结论近端感觉神经与远端运动神经端端吻合可有效延缓失神经肌肉萎缩。

臂丛损伤；感觉神经；失神经；肌萎缩；手内在肌

高位神经损伤如臂丛或高位尺、正中神经损伤，治疗效果不佳。原因是神经吻合后再生神经纤维生长速度缓慢，平均每天生长仅1 mm左右；靶器官距离神经损伤部位远，失神经支配时间过长，在等待神经修复期间，失神经肌肉发生明显肌肉萎缩、纤维化及运动终板退变等，从而极大地限制了功能恢复[1，2]。周围神经损伤后治疗效果主要依赖于失神经支配时间[3，4]。那么对于高位周围神经损伤，在神经再生至失神经骨骼肌前，如何防止或延缓失神经肌肉萎缩。很早就有学者对感觉神经延缓失神经肌萎缩进行了研究，Weiss等尝试应用感觉神经保护失神经肌肉，效果不佳[5，6]。Zhang等[7]通过实验研究证明躯体感觉神经对失神经肌肉有保护作用。随后，Hynes等[8]也建立了不同感觉神经元延缓失神经肌萎缩动物模型，显示背根神经节及感觉神经均有延缓失神经肌萎缩作用。臂丛C8、T1或下干损伤，如何防止或延缓前臂或手内肌萎缩，在神经吻合延缓失神经肌萎缩方法中，应用感觉神经如桡神经浅支或前臂外侧皮神经作为供体神经防止或延缓前臂肌或手内肌萎缩似乎是唯一选择。为充分了解供体为感觉神经的端端吻合方法对防止或延缓失神经支配骨骼肌萎缩的作用，我们设计了本次实验，以期为临床治疗提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 实验分组和动物模型建立 健康成年雄性SD大鼠40只，北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号：SLXK京2009-0004。饲养消毒饲料，饮用消毒水，室温(23±0.58)℃，湿度56%，12～12 h间隔照明，定期紫外线消毒与排风，体重在300～400 g之间，被随机分成两组，实验组(n=20)感觉神经移植保护组，对照组(n=20)即纯失神经组。每个动物手术对侧上肢不做任何手术处理(手术侧为右侧)，作为正常对照组(n=40)。第一阶段：实验组：根据Ebert和Terzis模型[9]，采用锁骨上神经后、中两根于其远端横断，锁骨下解剖肌皮神经，将锁骨上神经后、中两根近端与肌皮神经远端吻合，完成近端感觉神经和远端运动神经吻合。对照组：仅完成锁骨下臂丛神经解剖，在肌皮神经接近C6椎孔横断，横断后无张力固定于邻近胸肌内、为纯失神经模型。第二阶段：6个月后，实验组：首先行锁骨上神经后、中两根近端与肌皮神经远端吻合部神经切除术，并将支配胸小肌的运动神经2分支横断，与肌皮神经的远端吻合，完成运动神经和运动神经端端吻合。对照组：胸小肌的运动神经2分支与肌皮神经远端吻合。第二阶段术后4周及8周时，按时间分为4周组和8周组，每组10只。

1.2 检测项目

1.2.1 行为评估 理毛试验，采用The Terzis grooming评分。实验方法为用5 mL注射器向老鼠的鼻子喷5 mL自来水，同时观察大鼠试图去拭掉鼻子水时的两上肢肘屈曲的程度，右侧上肢肘曲的评分指导为：a)0分：没有屈肘；b)1分：肘屈曲但未达到鼻子；c)2分：肘屈曲并达到鼻子；d)3分：肘屈曲并达到眼下；e)4分：肘屈曲并达到眼；f)5分：肘屈曲到达耳朵并超过它。

1.2.2 运动单位电位 采用丹麦Keypoint肌电仪测量肱二头肌的运动单位电位。

1.2.3 术中电刺激 第二阶段术后4周及8周时仔细解剖出吻合的两根神经即肌皮神经和胸内侧神经，用便携式直流神经刺激器分别设置0.5 mA、1 mA、1.5 mA，于神经吻合部位的近端刺激神经，并同时观察肱二头肌的收缩情况。

1.2.4 肌湿重测量 第二阶段术后4周及8周时将两侧肱二头肌完整取下，在电子微量天平BT 1250(德国Sartorius公司)迅速称重，将左侧数值与右侧数值相除，得肌湿重恢复率。

1.2.5 肌纤维细胞的直径及横截面积 第二阶段术后4周及8周时取实验组、对照组与正常对照组肱二头肌中段肌组织进行梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制成5 μm厚的横截面积切片，HE染色后，用HPLAS-1000高清晰度彩色病理图像分析系统测定肌细胞直径及截面积，并以右侧数值除以左侧数值得其肌纤维直径及横截面积的恢复率。

1.2.6 二头肌运动终板数 第二阶段术后4周及8周时取用已解剖下了的肱二头肌的中上部，用美国光学恒冷切片机切成30 μm的切片，然后用20%的硫酸钠浸泡并用改良的乙酰胆碱技术染色，采用HPIAS-1000高清晰度彩色图像分析系统，将运动终板染色片经显微镜输入计算机图像分析系统，在400倍视野下，随机选取6个视野，运动终板数的总数=6个单个视野运动终板数量的统计之和。

2 结 果

2.1 行为评估 理毛试验结果采用The Terzis grooming评分标准[10]，2周时实验组及对照组(P<0.05)，出现优势高峰。3周后两组实验结果并没有随时间延长而有明显差异(见图1)。

2.2 运动单位电位波幅 两组肌电图(见图2)显示均有大量形态不规则运动单位电位，呈现规律波幅振荡，变化规律相似.实验组运动单位电位于4周和8周时都明显高于对照组波幅高度(P<0.05)(见表1)。

图1 两组行为评估示意

a 4周实验组(◀)与对照组(↑)波幅振荡规律相似，实验组波幅明显高于对照组 b 8周实验组(◀)与对照组(↑)波幅振荡规律相似，两组振荡波幅减小，但实验组波幅明显高于对照组

图2 两组4周、8周时肌电图

2.3 术中电刺激 术中便携式直流神经刺激器分别设置0.5 mA、1 mA、1.5 mA三个电流刺激强度，刺激肌皮神经和胸内侧神经神经吻合部位近端，记录结果见表2～3，结果显示实验组对电流刺激比对照组敏感。

表2 第4周时术中电刺激肌肉收缩例数(n=20，例)

表3 第8周时术中电刺激肌肉收缩例数(n=10，例)

2.4 肱二头肌湿重 肱二头肌变化图(见图3)，4周时对照组肌萎缩比实验组明显，8周时对照组与实验组肌萎缩相差不明显。肱二头肌湿重数据显示(见表4)，实验组肌肉湿重恢复率明显好于对照组(P<0.05)。肱二头肌湿重恢复率=右侧数值/左侧数值×100%。

表4 两组肱二头肌湿重恢复率分析结果(%

a 4周时肌萎缩明显(对照组) b 4周时肌萎缩较轻(实验组) c 8周时肌萎缩较轻(对照组) d 8周时肌萎缩轻(实验组)

注：左侧均为非手术侧，右侧均为手术侧

图3 两组4周、8周时肱二头肌变化图

2.5 肌纤维细胞的直径及横截面积 第二阶段术后第4周和8周时候肱二头肌肌纤维直径(见表5)及横截面积恢复率(见表6)，采用HE染色(见图4)。横截面积恢复率=其肌纤维横截面积的右侧数值/左侧数值×100%。从表5～6中可以说明，本实验中实验组有更明显优势在神经恢复后期表现，实验组肌纤维直径及肌纤维横截面积恢复率比对照组有明显优势(P<0.05)，这也说明了在神经恢复之前保护肌肉组织重要性。

2.6 二头肌运动终板数 数据分析无论是感觉神经保护组还是失神经组的运动终板数是随着运动神经供体修复神经之后随着时间推移有大量恢复，但感觉神经保护组恢复率更好，在4周时统计发现感觉神经保护组有更多运动终板数且比失神经组有明显数量优势(P<0.05)，8周时感觉神经保护组也比失神经组运动终板数量上有非常明显优势(P<0.05)(见表7)。

表5 两组肌纤维直径分析结果

表6 两组肌纤维横截面积的恢复率分析结果(%

a 4周时对照组可见明显结缔组织增生，肌束间隙增宽，肌细胞破坏明显，形态不规则，数量明显少量(HE，×200) b 4周实验组可见结缔组织增生，肌束间隙较宽，肌细胞破坏较轻，形态较规则，数量较多(HE，×200) c 8周对照组可见结缔组织增生较轻，肌束间隙变窄，肌细胞破坏较轻，且细胞形态较规则，数量明显增多(HE，×200)d 8周实验组可见结缔组织增生轻，肌束间隙窄，细胞形态规则，数量多(HE，×200)

图4 两组4周、8周时组织学图片

表7 两组肱二头肌运动终板数分析结果(个

3 讨 论

臂丛神经或高位尺、正中神经损伤，是临床治疗难题。主要原因是神经损伤部位距离前臂和手内肌远，再生神经长入靶器官之前，失神经肌肉已经萎缩、纤维化、运动终板退变等。那么如何在神经再生重建功能之前延缓失神经肌萎缩成为研究热点。规律电刺激[11]、弱光治疗[12]、药物治疗[13]、组织工程学疗法[14]、神经营养因子疗法[15]、干细胞移植[16]、基因治疗等，均有效果但不理想。神经端侧吻合后，供体神经侧枝芽[17]，再生神经纤维通过损伤神经远端来支配肌肉以防止或延缓骨骼肌萎缩，通过供体为混合或运动神经的神经端侧吻合技术以防止或延缓失神经支配骨骼肌萎缩已有较多报道[2，18，19]，是一种较为理想的方法，但对于臂丛C8、T1或下干损伤，前臂或腕部已无可供端侧吻合的混合或运动神经，那么如何对失神经前臂和手内在肌进行保护？应用感觉神经保护运动神经是不能提高运动神经恢复之后肌纤维收缩功能的，但能给肌细胞一个持续营养环境，保留大量肌肉质量是可以做到的，可延缓失神经肌萎缩[20-23]。为验证感觉神经延缓失神经骨骼肌萎缩的作用，我们设计了本实验。第一阶段，把感觉神经保护组动物饲养时间延长至6个月，目的是给感觉神经充分时间以发挥它们的营养效果。结果显示：实验组运动单位电位明显高于对照组波幅高度；实验组肱二头肌肌纤维多且粗大，结缔组织少优于对照组；实验组肱二头肌收缩优于对照组；实验组运动神经终板染色更集中，数量多优于对照组。这些实验结果说明感觉神经与远端运动神经吻合可对所支配肌肉和运动终板具有保护作用。本实验中一个重要发现，就是在第二次手术后2周时，理毛试验结果实验组明显优于对照组，但这种优势并不持久，在3周后，实验组与对照组无差别。可能在2周时，由于感觉神经保护组提供了一个更好的营养环境，使得运动神经再支配快于对照组。但在3周后，实验组与对照组结果逐渐趋向一致，说明肌肉都获得神经再支配，按上述检测结果，在理毛实验，实验组鼠上肢上举幅度应强于对照组，但结果是术后4周与8周实验组与对照组无差别。再生效果的判断主要来源于电生理、神经形态学及靶(肌)组织方面，但即使上述三方面有良好的改善，伤肢运动、感觉也可能恢复不满意，可能的原因为：a)主动运动和被动运动是两个概念，电刺激有肌肉收缩并不代表能够主动运动，感觉神经对运动终板具有保护作用，但这些受保护的运动终板再神经支配后是否都能形成有效的电活动，从而诱发肌肉收缩；b)支配不同神经的大脑皮层区域定位不同，需要逐渐调控和适应。前臂远端和腕部可提供保护的感觉神经主要有桡神经浅支、前臂外侧皮神经、尺神经手背支、正中神经掌皮支，如果为臂丛C8、T1或下干损伤，可应用桡神经浅支和前臂外侧皮神经作为供体神经与骨间掌侧神经、尺神经深支、正中神经大鱼际支吻合以延缓其所支配肌肉萎缩。运动神经对失神经支配肌肉的作用已被广泛接受，但感觉神经营养失神经肌肉机理不明，可能与感觉神经是有髓神经，能够分泌部分神经源性营养因子有关，如乙酰胆碱、睫状神经营养因子等[24]。感觉神经延缓失神经肌萎缩还有许多问题需要解决，如怎样更好地保护运动终板、神经再支配后如何更好地恢复肌肉主动运动功能，我们会对其机制进行进一步研究。

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Experimental Study of the Effect of Sensory Nerve on Protection and Retard the Denervated Muscular Atrophy

WANG Bin1，CHEN Yue2，YANG Huan-you1，etal

(1.The Department of Hand Surgery，The Second Hospital of Tangshan，Tangshan 063000，China；2.Department of Orthopaedics，Handan Central Hospital，Handan 056300，China)

ObjectiveTo investigate the effect of sensory nerve of retarding the denervated muscular atrophy.MethodsAdult male SD rats 40 were randomly divided into two groups.The experimental group(n=20) was the sensory nerve graft protection group，the control group(n=20) was only denervated group.In the first stage，the control group underenent musculocutaneous nerve.The experiment group underuent proximal supraclavicular nerve and the distal end of the musculocutaneous nerve anastomosis.After 6 months，the experimental group and the control group underument the musculocutaneous nerve and the pectoralis minor muscle motor nerve branch anastomosis.After 4～8 weeks，to measure the rat hair experiment，fibrillation potentials，the muscle wet weight，muscle HE staining，motor end-plate staining counting respectively.ResultsThe experimental group after fourth and 8 weeks of fibrillation potential amplitude was significantly higher than that in the control group，current stimulation sensitivity was significantly better than the control group，two head of the muscle wet weight recovery rate was significantly higher than that of control group，thicker muscle fiber diameter，with more number of motor endplate，grooming experimental surgery second weeks has obvious advantage.ConclusionThe anastomosis of the proximal sensory nerve and the distal motor nerve can significantly retard denervated muscular atrophy.

brachial plexus injury；sensory nerve；denervation；muscle atrophy；intrinsic muscles of hand

1008-5572(2014)03-0232-05

R651.3

：A

2013-08-13

王斌(1966- )，男，主任医师，唐山市第二医院，063000。