蒽贝素对三氧化二砷抑制白血病干细胞生长的影响

张健

(新乡医学院第一附属医院 儿内科，河南 新乡 4530000)

白血病是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一，是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病。白血病干细胞(leukemia stem cells，LSCs)概念最早于1994年被提出，Dick等通过实验证实了LSCs的存在。LSCs具有强大的自我更新能力，多向分化潜能，产生耐药等特点［1］。LSCs被认为是导致白血病耐药和复发的根源［2］。

三氧化二砷具有诱导肿瘤细胞分化、凋亡等作用，用于治疗急性早幼粒细胞白血病取得了突出的疗效，有学者认为三氧化二砷是通过降低磷酸甘露糖异构酶基因(phosphomannose isomerase，PMI基因)而靶向清除慢性粒细胞白血病患者体内的白血病干细胞［3］。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAPs)是近年来备受瞩目的一类蛋白质家族，独立于Bcl-2的抗凋亡蛋白。某些IAPs成员异常高表达常引起细胞凋亡受阻，与肿瘤的发生发展密切相关。X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂。X连锁凋亡抑制蛋白是肿瘤细胞内抑制凋亡发生的重要蛋白之一。蒽贝素是一种XIAP的小分子抑制剂，能够通过抑制XIAP，进而诱导肿瘤细胞的凋亡［4-6］。本研究将蒽贝素与三氧化二砷联合应用，考察XIAP的小分子抑制剂蒽贝素对三氧化二砷抑制白血病干细胞生长的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 二氧化碳细胞培养箱(美国热电公司);流式细胞仪(美国贝克曼公司);DMEM高糖培养基(美国GIBCO公司);胎牛血清(美国康宁公司);蒽贝素(美国sigma公司);MTT试剂盒(sigma公司);注射用三氧化二砷(北京双鹭药业);其余试剂为分析纯。人急性髓细胞白血病细胞株(KG-1a，购自ATCC);非糖尿病型严重的联合的免疫缺陷小鼠(成都达硕实验动物公司，动物许可证号:2013069283)。

1.2 白血病干细胞培养 人急性髓细胞白血病细胞株KG-1a购自美国ATCC，表达CD34+CD19+CD38+/-的KG-1a白血病干细胞由南京凯基生物分离。将KG-1a白血病干细胞置于含有100mg/L胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养条件为5%CO2，饱和湿度，温度为37℃。待细胞汇合度为0.8～0.9时，用2.5mg/L胰酶消化传代，取对数生长期细胞进行实验，将白血病干细胞分为生理盐水组、三氧化二砷组、蒽贝素组和三氧化二砷+蒽贝素组。

1.3 白血病干细胞增殖抑制实验 培养KG-1a白血病干细胞接种于96孔板中，当孔板中细胞完全贴壁且处于对数生长期时加入无菌过滤后的生理盐水、三氧化二砷注射液(1 mmol/mL)、蒽贝素溶液(40 mmol/mL)和三氧化二砷(1 mmol/mL)与蒽贝素(40 mmol/mL)混合溶液各20μL，使各孔终体积为200μL。每组设5组重复。将孔板移入37℃ CO2孵箱中分别培养24、48 h后取出，每孔加入20μL 5mg/mL MTT溶液，再放回孵箱中继续孵育4 h，将孔板中液体倒出，每孔加入200μL DMSO，37℃避光振摇15 min，用荧光读数仪在490 nm处测定各孔的光密度值。

1.4 白血病干细胞凋亡实验 按“1.2”项下培养细胞并给药，将KG-1a白血病干细胞给药孵育24 h，然后用冰PBS清洗细胞3次，FITC/PI双染，细胞避光放置15 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡数量。

1.5 细胞划痕实验 细胞划痕实验(wound healing assay)用来在体外判断肿瘤细胞的运动性和迁移能力。收集生长良好的KG-1a白血病干细胞，接种于12孔细胞培养板中，待细胞生长融合率达到80%左右，用20μL移液枪头垂直培养板机械性地划出3条平行线，并用PBS洗涤细胞3次，保证划痕处没有细胞，补加完全培养基继续培养。按照“1.2”项下给药方法给药，分别于37℃，5%CO2培养箱中培养4～6 h后，更换新鲜完全培养基，然后继续培养18 h，考察划痕两侧细胞间的距离和细胞迁移情况。

1.6 荷白血病小鼠模型动物实验 参照Saprap等方法［7］将培养的KG-1a白血病干细胞通过尾静脉注射入非糖尿病型严重的联合的免疫缺陷小鼠体内，建模3 w后断尾取血观察小鼠外周血可见白血病细胞数目。取建模成功小鼠24只随机分为4组，每组6只，分别为生理盐水组、三氧化二砷注射液组(3mg/kg)、蒽贝素溶液组(120mg/kg)和三氧化二砷(3mg/kg)与蒽贝素(120mg/kg)混合溶液组。于分组后第3、6、9、12和15天给药，观察并记录各组小鼠的生存期，绘制生存曲线。

2 结果

2.1 蒽贝素对三氧化二砷抑制白血病干细胞增殖的影响MTT实验结果显示，三氧化二砷和蒽贝素对KG-1a白血病干细胞均有一定的增殖抑制作用。当三氧化二砷与蒽贝素联合用药时，对KG-1a白血病干细胞的增殖具有更强的抑制作用，联合用药对白血病干细胞的抑制能力显著强于单独用药，差异具有统计学差异(P＜0.05，见图1)。

图1 不同药物干预对KG-1a白血病干细胞存活率的影响*P＜0.05，与生理盐水相比;#P＜0.05，与三氧化二砷和蒽贝素比较;ΔP＜0.05，与24 h的三氧化二砷+蒽贝素比较Fig.1 Effect of various drugs on KG-1a cell viability*P＜0.05，compared with control group;#P＜0.05，compared with As2 O3 or embelin;ΔP＜0.05，compared with As2O3+embelin at 24 h

2.2 蒽贝素对三氧化二砷促进白血病干细胞凋亡的影响研究药物体外诱导KG-1a白血病干细胞凋亡的定量实验结果表明，三氧化二砷、蒽贝素和联合给药都能不同程度诱导白血病干细胞的凋亡。各组诱导白血病干细胞坏死和早期凋亡率分别为36.96%、35.1%和94.1%，而对照生理盐水组早期凋亡率为0.24%(见图2)。

图2 各给药组对白血病干细胞凋亡的影响A:生理盐水组;B:三氧化二砷组;C:蒽贝素组;D:联合用药组Fig.2 Effect of various drugs on KG-1a leukemia stem cells apoptosisA:saline group;B:As2 O3 group;C:embelin group;D:As2 O3+embelin group

2.3 蒽贝素联合三氧化二砷对细胞迁移的影响 细胞划痕实验结果如图3所示:生理盐水组，三氧化二砷干预组和蒽贝素干预组的细胞均向中间划痕区域生长，即细胞向“伤口”内运动迁移。而联合干预组处理后的细胞这种现象减弱很多，仅有少数的细胞向划痕中央迁移，但是比各单独给药组和生理盐水组要少很多。结果说明，三氧化二砷和蒽贝素联合干预能够有效抑制KG-1a白血病干细胞的“伤口愈合”，从而影响KG-1a白血病干细胞的迁移性。

图3 各给药组对KG-1a白血病干细胞迁移能力的影响Fig.3 Effect of various drugs on KG-1a leukemia stem cells motility and migration

2.4 蒽贝素联合三氧化二砷对荷瘤鼠中位生存期的影响荷瘤小鼠给药第5次后停止给药，直至小鼠全部自然死亡，统计各组小鼠的生存期，绘制Kplan-Meier曲线(见图4)。结果显示:生理盐水组，蒽贝素组，三氧化二砷组和联合给药组的中位生存期分别为23、26、31和37d，联合给药能够显著延长荷瘤小鼠的生存期。

图4 各组荷瘤小鼠的kaplan-meier曲线1.生理盐水组;2.蒽贝素组;3.三氧化二砷组;4.三氧化二砷组+蒽贝素组Fig.4 kaplan-meier curves of tumor rats after treated with different drugs1.saline group;2.embelin group;3.As2 O3 group;4.As2 O3+embelin group

3 讨论

造血干细胞是最早被证实存在的干细胞，而“肿瘤干细胞”这一概念最早被应用于白血病。学术界广泛认为肿瘤干细胞是肿瘤耐药、复发的根源［2］。目前针对白血病干细胞的治疗策略包括抑制干细胞的信号通路分子、诱导干细胞凋亡、改变肿瘤微环境相关分子等［8-9］。

2010年，香港大学医学院发现，若剂量适当，砒霜的潜在毒性会被解除，尤其是对心脏的副作用会大大减低，并成功把砒霜研发成为处方的口服药物，已治愈超过一百名血癌病人。患者接受此项治疗的存活率达七成［10-11］。口服砒霜还能应用于治疗其他癌症，包括淋巴癌和多发性骨髓瘤。目前国内外的研究者们对三氧化二砷的抗肿瘤机制进行了广泛而深入的研究，己证实三氧化二砷不仅对血液系统肿瘤有效，其对实体瘤如乳癌、肺癌、膀胱癌、神经母细胞瘤、头颈部肿瘤、食管癌、胃癌、肝癌的生长和增殖均有抑制作用［12-14］。蒽贝素是一种XIAP的小分子抑制剂，能够通过抑制XIAP，进而诱导肿瘤细胞凋亡。蒽贝素与其他化疗药物联用能够有效增强化疗药物对肿瘤细胞的抑制效果［15］。

本研究将三氧化二砷与蒽贝素联合用于白血病干细胞的治疗研究。研究结果表明，三氧化二砷联合蒽贝素能够有效抑制KG-1a白血病干细胞的增殖，蒽贝素能够促进三氧化二砷诱导KG-1a白血病干细胞凋亡。肿瘤干细胞具有强大的自我更新能力和多向分化潜能。本研究通过细胞划痕实验考察给药后肿瘤细胞的迁移能力。迁移是肿瘤细胞转移过程中的一个重要环节。迁移就是肿瘤细胞与母体瘤分离，穿越血管壁，侵袭周边正常组织时，需要一定的运动能力。结果显示出联合用药能够有效抑制白血病干细胞的迁移。体内荷瘤鼠治疗实验结果显示，与对照组生理盐水和各单独给药组相比，联合给药都能够有效延长荷瘤小鼠的中位生存期。

综上所述，蒽贝素能够有效增强三氧化二砷对白血病干细胞的增殖抑制作用，诱导白血病干细胞凋亡，其机制与蒽贝素的抑制剂XIAP有关。三氧化二砷与蒽贝素联合应用是一种潜在的抗肿瘤干细胞治疗方法。

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