天麻素对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用研究

李文君，徐振田，索大琴，谢安智

(厦门大学医学院 基础医学部，福建 厦门 361000)

免疫性炎症反应参与了缺血性中风后的脑损伤。脑缺血后数小时，受损脑区域的炎症反应开始启动，持续数天后，使脑缺血所致的迟发性脑损伤加重。脑缺血后释放大量自由基、炎症因子和前炎症物质，损害中枢神经系统，促使神经细胞死亡，加重缺血性中风的损伤，因此脑缺血损伤中的炎症反应越来越受到关注［1-3］。天麻(Gastrodia rhizome)为兰科植物的干燥块茎，其有效成分天麻素(Gastrodine)对中枢神经系统、心血管系统和免疫系统有较广泛的药理活性，能扩张脑血管、增加脑血流量、提高脑细胞抗缺氧能力［4-5］。天麻素是否影响脑缺血再灌注损伤血脑屏障的通透性，是否影响到缺血半暗带的炎症反应，目前尚未见报道。

本研究在大鼠急性局灶性脑缺血再灌注损伤模型基础上，通过测定天麻素对梗死半暗带皮层组织内TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达的影响，旨在深入研究天麻素对脑缺血过程中炎症反应的作用，为临床治疗脑缺血提供理论依据和实验支持。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂与仪器 天麻素(Gas)，上海永叶生物科技有限公司;兔抗鼠 TNF-α、IL-1β、IL-6抗体，Abcam 公司，兔抗鼠β-actin单克隆抗体，Santa Cruz公司;ECL发光系统，联科生物公司;2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC)，美国 Amresco公司;其它均为市售分析纯产品。

显微手术器械，上海医疗器械有限公司;多功能酶标仪，美国Molecular Devices公司;Western blot装置，美国BioRad公司;Kodak IS4000R全自动图像工作站，美国Kodak公司。

1.2 实验动物 清洁级SD大鼠120只，雄性，体质量250～300 g，由厦门大学医学院实验动物中心提供，合格证号:SYXK(闽)2013－0003。术前12 h禁食，自由饮水。

1.3 方法

1.3.1 大鼠大脑中脉栓塞脑缺血模型的制备:线拴法制备大鼠右侧大脑中动脉栓塞模型(middle cerebral arteryocclusion，MCAO)［6］。大鼠称重、麻醉;分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉;用动脉夹夹闭颈总动脉，在颈总动脉和颈内动脉分叉处剪一小口，将线栓经切口处插入大脑中动脉始端，栓塞大脑中动脉，造成局灶性脑缺血，缺血2 h后拔出线栓，即形成再灌注，动物苏醒后出现对侧肢体运动障碍即为模型制备成功。

1.3.2 分组及给药:为评价Gas对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响，50只SD大鼠随机分为5组:①假手术组(Sham组):仅手术暴露右侧颈总动脉及颈内动脉，不做缺血处理;②溶媒组(Model组):造模后缺血2 h后再灌注;③～⑤Gas给药组(5、10、20mg/kg组):脑缺血再灌注同时分别给予Gas 5、10、20mg/kg腹腔注射。

1.3.3 免疫印迹:为检测Gas对大鼠脑缺血后梗死半暗带炎症因子的作用，在脑缺血后24 h处死大鼠，取梗死半暗带皮层组织，加入裂解液冰上裂解30 min后，14 000 r/min离心10 min，上清即为总组织蛋白溶解成分。SDS-PAGE每孔上样量为50 ug，蛋白经电泳分离后，将胶上蛋白转印到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，然后分别加入1∶1000稀释的兔抗大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6多克隆抗体，4℃孵育过夜，再加入1∶5 000稀释的羊抗兔二抗，37℃孵育1 h，用化学荧光试剂检测，使用Kodak IS4000R系统检测成像分析。实验以β-actin为内参蛋白。

1.3.4 脑损伤的评价

①神经功能缺失评分:大鼠脑缺血后再灌注24 h参照Longer 5分法［7］进行神经功能学评分。

②脑梗死灶体积及脑水肿的测定:大鼠脑缺血后再灌注2 h，断头取脑，于－20℃中冷冻30 min，切成2.0 mm厚的冠状切片，放于1%TTC溶液中，避光37℃恒温孵育20 min，4%多聚甲醛溶液中避光固定24 h后，运用图像分析处理软件计算脑梗死体积。

③血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)破坏程度的观察和测定:大鼠脑缺血后再灌注6 h，尾静脉注射质量浓度为5%的伊文思蓝(evansblue，EB)，剂量 10mL/kg，18 h 后，给予水合氯醛麻醉后打开胸腔，于右心耳部剪一小口，从左心室插入导管至主动脉，向主动脉内缓慢注入生理盐水，直到右心房流出液体变清亮，断头取脑，整脑拍照后，于－20℃中冷冻15 min，切成2.0 mm厚的冠状切片。未受损的正常脑组织无EB渗透呈白色;梗死侧脑组织有大量EB渗透呈蓝色，说明血脑屏障受损。用相机按顺序拍摄染色后的脑片，用图像分析与处理软件计算每个脑片EB渗透面积，EB渗透体积为:面积求和后乘以切片厚度(2 mm)。

1.4 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件分析，正态计量数据用“±s”表示，组间比较做单因素方差分析，两两比较选用LSD-t法分析。

2 结果

2.1 Gas对大鼠脑缺血损伤的保护作用 大鼠脑缺血再灌注后24 h，损伤侧脑组织出现明显的苍白梗死灶，Gas 10，20mg/kg再灌注同时给药可剂量依赖性减小脑梗死体积，Gas 5mg/kg无效(图1a，1b)。大鼠脑缺血再灌后24 h，出现明显的神经功能损伤，与Sham组相比，神经功能缺失评分明显升高;Gas给药组(10、20mg/kg)可减少神经功能缺失评分，并呈剂量依赖性，Gas 5mg/kg组无影响(见图1c)。

图1 Gas对大鼠脑缺血的保护作用##P＜0.01，与Sham 组相比;*P＜0.05，＊＊P＜0.01，与Model组相比Fig.1 Protection effect of Gas on cerebral ischemia rats##P＜0.01，compared with Sham group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with Model group

2.2 Gas对大鼠脑缺血后BBB通透性的影响 通过EB渗漏法观察脑缺血再灌注后大鼠BBB通透性的变化，表明脑缺血再灌注后24 h，脑内 EB渗漏量明显增大(见图2a)。Gas(20mg/kg)再灌后给药后EB的渗漏体积与Model组相比明显减少(P＜0.05)，表明Gas(20mg/kg)可减少EB在脑内的渗漏，减轻脑缺血再灌注后BBB的破坏程度(见图2b)。

图2 Gas对大鼠脑缺血后BBB通透性的影响##P＜0.01，与Sham组相比;*P＜0.05，与Model组相比Fig.2 Effect of Gas on BBB disruption in brain ischemia rats##P＜0.01，compared with Sham group;*P＜0.05，compared with Model group

2.3 Gas(20mg/kg)对脑缺血后大鼠皮层梗死半暗带TNF-α蛋白表达的影响 大鼠脑缺血再灌注24 h，皮层梗死半暗带TNF-α蛋白表达明显增加，Gas(20mg/kg)脑缺血再灌注同时给药可降低梗死半暗带TNF-α蛋白表达，抑制率为24%(见图3)。

图3 Gas对大鼠脑缺血梗死半暗带皮层组织TNF-α蛋白表达的影响##P＜0.01，与Sham组相比;*P＜0.05，与Model组相比Fig.3 Effect of Gas(20mg/kg)on TNF-αexpression in penumbra of cortex tissue after cerebral ischemia##P＜0.01，compared with Sham group;*P＜0.05，compared with Model group

2.4 Gas(20mg/kg)对脑缺血后大鼠皮层梗死半暗带IL-1β蛋白表达的影响 大鼠脑缺血再灌注后24 h，皮层梗死半暗带IL-1β蛋白表达明显增加，Gas(20mg/kg)脑缺血再灌注同时给药可降低梗死半暗带IL-1β蛋白表达，抑制率为34%(见图4)。

图4 Gas(20mg/kg)对大鼠脑缺血梗死半暗带皮层组织IL-1β的表达的影响##P＜0.01，与Sham组相比;*P＜0.05，与Model组相比Fig.4 Effect of Gas(20mg/kg)on IL-1βexpression in penumbra ofcortex tissue after cerebral ischemia##P＜0.01，compared with Sham group;*P＜0.05，compared with Model group

2.5 Gas(20mg/kg)对脑缺血后大鼠皮层梗死半暗带IL-6蛋白表达的影响 大鼠脑缺血再灌注后24 h，皮层梗死半暗带IL-6蛋白表达明显增加，Gas(20mg/kg)脑缺血再灌注同时给药可降低梗死半暗带IL-6蛋白表达，抑制率为38%(见图5)。

图5 Gas(20mg/kg)对大鼠脑缺血梗死半暗带皮层组织IL-6的表达的影响##P＜0.01，与Sham组相比;*P＜0.05，与Model组相比Fig.5 Effect of Gas(20mg/kg)on IL-6 expression in penumbra of cortex tissue after cerebral ischemia##P＜0.01，compared with Sham group;*P＜0.05，compared with Model group

3 讨论

脑血管疾病是继恶性肿瘤和心血管疾病之后，威胁人类生存与健康的第三大疾病，因具有高发病率、高致残率、高死亡率的特点，给社会家庭带来严重的经济和精神负担，其中缺血性脑血管病占全部脑血管病的80%［7］。随着我国老龄化趋势增强，缺血性脑血管疾病患者人数急剧上升。因此，寻找脑缺血保护作用的药物意义重大。

天麻素是天麻的有效成分。以往研究表明天麻素可不同程度地增加脑血流量，降低血管阻力，抑制神经细胞凋亡［8-9］，改善老龄大鼠的学习记忆等功能［10］。BBB是存在于血液和脑组织之间的一道屏障，对维持中枢神经系统内环境稳定起着重要作用。本实验采用EB为示踪剂，观察脑缺血再灌注后脑内BBB通透性的变化，选取EB在脑内渗漏最明显的时间即再灌注6 h作为观察药物作用的时间点［11］。脑缺血再灌注会破坏BBB完整性，导致血液中的成分渗入脑组织，形成血管源性脑水肿，进一步加重脑损伤。本实验结果表明:脑缺血再灌注同时给药Gas(20mg/kg，i.p)可明显减少EB在脑内的渗漏，说明Gas对脑缺血/再灌注后的BBB具有保护作用，其通过保护BBB的完整性减轻脑缺血再灌注损伤。此外，本研究还表明Gas在改善BBB的同时可减少脑梗死体积及改善神经功能缺失。

炎症反应是造成脑卒中后继发性损伤的主要因素之一［12-13］，脑缺血后再灌注损伤可激活大量炎症细胞释放炎症介质，加重局部脑组织损伤。如何抑制炎性因子释放，是减轻缺血性脑损伤中一个非常重要的环节。TNF-α是一种在诱导炎症反应中很重要的细胞因子，其在脑缺血早期生成的增加是脑梗塞形成的主要原因［14］。IL-6对于多种细胞的生长、分化与调控都有影响，其过度表达与缺血性脑损伤密切相关。缺血再灌注大鼠与临床卒中患者的中枢神经系统均会产生IL-6，其表达水平的高低是评价缺血再灌注损伤程度的一个重要指标［15］。本研究通过建立大鼠脑缺血/再灌注模型，证实了Gas可减轻脑缺血神经功能损伤和降低脑梗死体积，且具有剂量依赖性，Gas 20mg/kg的保护作用更为明显。为了进一步研究Gas脑保护的作用机制，检测了TNFα、IL-1β和IL-6在梗死半暗带皮层组织中的表达，结果显示脑缺血后半暗带TNFα、IL-1β和IL-6蛋白表达明显升高，而Gas 20mg/kg可抑制TNFα、IL-1β和IL-6的表达。说明Gas也可通过减轻脑缺血后的炎症反应，进一步减轻缺血性脑损伤。

本研究结果表明Gas对大鼠脑缺血/再灌注损伤具有保护作用。通过抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的释放，改善血脑屏障的完整性可能是Gas保护缺血性脑损伤的机制。

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