聚酰胺色谱结合高速逆流色谱分离制备萹蓄黄酮类化合物

孙兆林，王 晓，王岱杰，李 佳，段文娟*

1山东中医药大学药学院，济南 250355;2山东省分析测试中心山东省大型精密分析仪器应用技术重点实验室，济南 250014

萹蓄为蓼科植物萹蓄Polygonum aviculare L.的干燥地上部分［1-3］。《本草纲目》中载，用于“治霍乱，黄疸，利小便”。《滇南本草》载:“利小便。治五淋白浊、热淋、瘀精涩闭关窍，并治妇人气郁，胃中湿热，或白带之症”等效用。现民间广泛用其治疗泌尿系统的感染，结石及肾炎等疾病［4-6］。现代临床学报道:萹蓄对非胰岛素依赖性糖尿病患者的治疗是一种理想的药物，疗效显著而持久，且无毒副作用［7］。因此建立相关成分的高效分离纯化方法具有重要意义。

目前，萹蓄中化学成分的分离纯化主要采用薄层色谱、硅胶柱色谱、聚酰胺柱色谱等传统的分离纯化方法［8］。这些方法存在耗时长、容易造成样品的不可逆吸附变性及样品回收率低等缺点。高速逆流色谱技术(high-speed counter-current chromatography，HSCCC)是不使用固态载体的液-液分配色谱［9，10］，根据样品在两相溶剂中分配系数的不同实现样品的分离，避免了固相载体对样品的不可逆吸附、变性等缺点，已广泛应用于天然产物的分离纯化领域［11-16］。本研究首先采用聚酰胺色谱法对萹蓄中的黄酮类化合物进行富集，然后采用HSCCC 对富集了黄酮类成分的馏分进行分离纯化，通过两种色谱方法的结合，实现了对萹蓄中黄酮类化合物快速、有效的分离纯化，得到了3 个高纯度的黄酮类化合物，分别为杨梅树皮苷，黄芪苷和合欢草素1(图1)，为萹蓄资源的进一步开发应用提供了一定的参考依据。

图1 杨梅树皮苷、黄芪苷、合欢草素1 化学结构式Fig.1 Chemical structures of myricitrin，astragalin and desmanthin-1

1 仪器与材料

高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司)、TBP5002 泵(上海同田生物技术有限公司)、8823-B 紫外检测器(北京宾达英创科技有限公司)、3057-11 记录仪(重庆川仪总厂有限公司)、旋转蒸发仪(巩义市予华仪器有限公司)、KDM 型调温电热套(山东光明仪器有限公司)、超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)、SHB-B95 型循环水式多用真空泵(郑州长城科技工贸有限公司)、恒温循环器(郑州长城科技工贸有限公司)。Waters 600-996 高效液相色谱系统(配有光电二极管阵列检测器(PDA)，美国Waters 公司)、Varian INOVA-600 核磁共振波谱仪(美国Varian 公司)、Agilent 1100 Series 6320 ion-trap 质谱仪(美国Agilent 公司)，Agilent 6890N-5973N 气相色谱/质谱联用仪(美国Agilent 公司)。

甲醇、石油醚和乙酸乙酯均为分析纯(中国医药集团上海化学试剂公司);甲醇为色谱纯(美国天地公司);实验用水为过滤蒸馏水及娃哈哈纯净水;柱层析用聚酰胺粉(台州市路桥四甲生化塑料厂)。萹蓄药材购自山东中医药大学中鲁医院，经山东中医药大学李佳教授鉴定为蓼科植物萹蓄的全草。

2 实验方法

2.1 萹蓄粗提物的制备

将购买的2 kg 萹蓄药材，经粉碎机粉碎，过40目筛。将2 kg 药材粉末平均置于两个10 L 的圆底烧瓶中，加入6 倍量药材的95%乙醇，加热回流提取3 次，每次2 h，合并滤液，减压蒸馏浓缩至无醇味。浓缩液用适量水混悬后，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯萃取三次，得到乙酸乙酯层样品38.4 g。

2.2 聚酰胺色谱初步分离

聚酰胺的前处理:将聚酰胺放在95%的优质工业乙醇中煮沸0.5 h，取出晾干，换上新的乙醇再煮，重复3～4 次，直至乙醇液无白色为止，取出晾干备用。

乙酸乙酯萃取物用甲醇溶解，均匀的拌样于100 g 聚酰胺中，置70 ℃水浴锅上蒸干上柱，依次用30%、60%、95%的乙醇洗脱，分别冲洗三个柱体积，减压蒸干洗脱液分别得到馏分1(4.2 g)、馏分2(8.4 g)、馏分3(2.2 g)三个馏分，经HPLC 检测，馏分2(60%乙醇洗脱液)中具有黄酮类成分特征紫外吸收色谱峰(253 nm 和361 nm)的成分较多。

2.3 分配系数KD的测定

取少量样品置于1.5 mL 试管中，加入等量的上下相各0.5 mL，剧烈震荡0.5 min，使样品充分溶解，静置分层，取上下相各5 μL 分别用高效液相色谱(HPLC)进行检测，上相峰面积为A1，下相峰面积为A2，分配系数KD=A1∕A2。

2.4 两相溶剂体系及样品溶液的制备

本实验所用溶剂体系为乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(体积比4∶1∶5∶0.1)，按比例配制于分液漏斗中，剧烈振荡使溶液充分混合，室温下静置过夜，分出上下相，使用前超声脱气30 min 备用。

称取馏分2 样品150 mg，加入上下相各10 mL，振荡使其完全溶解，用于HSCCC 分离。

2.5 HSCCC 法分离制备过程

将两相溶剂体系中已超声脱气的上相(固定相)，以20 mL/min 的流速泵入HSCCC 螺旋管中，待上相充满整个螺旋管后，缓慢调节主机转速至850 rpm，顺时针旋转，待转速稳定后，自HSCCC 首端以2.0 mL/min 流速泵入下相，同时开启紫外检测器，检测波长为254 nm ;待上下相平衡后，将20 mL样品溶液通过六通进样阀注入HSCCC 色谱仪，根据色谱图收集各色谱峰馏分。

2.6 HPLC 条件

萹蓄馏分2 样品和HSCCC 分离后各色谱峰用HPLC 分析。色谱柱:Inertsil ODS-SP(250 mm ×4.6 mm，5 μm);柱温:25oC;检测波长:254 nm;流动相:甲醇(A)，0.2%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱程序:0～20 min，30%～70% A;20～30 min，70%～100%A;30～35 min，100% A。流速:1.0 mL/min;进样量:10 μL。

3 结果与讨论

3.1 HSCCC 分离条件优化

溶剂体系的选择是HSCCC 分离中的首要和关键环节，溶剂体系合适与否是由目标化合物在两相溶剂中的分配系数(KD)来衡量的。一般而言，对HSCCC 最合适的KD值范围是0.5～2.0［17］。本实验测定了目标化合物在不同体积比的乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸溶剂体系中的KD值。实验结果表明，当采用乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(体积比为4∶1∶5∶0.1)两相溶剂体系时，可实现目标化合物的分离。目标化合物在不同比例的乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸体系中的KD见表1。由表1 可看出乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸的体积比为3∶1∶6∶0.1、3∶2∶5∶0.1 时，3 种化合物的KD差异较大，能保证各组分间具有较好的分离度，但同时各物质在固定相中的分配较多且黄酮类化合物在固定相中的KD偏大，若采用这2 种溶剂体系会使整体的分离时间过长，分离效率低，难以实现萹蓄中黄酮类成分的快速高效分离纯化。如图2 所示，应用乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(体积比为4∶1∶5∶0.1)为两相溶剂体系时，3 种黄酮类成分能够在3h 之内实现分离且分离效果良好。

表1 萹蓄60%乙醇粗提物中3 种化合物在不同比例溶剂体系中的KD值Table 1 Partition coefficients (KD)of the 3 flavones from P.aviculare crude extract under different two-phase solve systems

3.2 HSCCC 分离纯化的结果

以乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(4∶1∶5∶0.1，v/v)为两相溶剂体系，按照1.6 节所述的方法对萹蓄馏分2 进行分离纯化。将150 mg 样品溶于20 mL 等体积上相和下相混合溶液中进行HSCCC 分离(分离谱图见图2)，根据图2 进行手动分段收集，得到化合物I、II，在尾吹液中得到化合物III。将各馏分减压浓缩干燥，其质量依次为7.5、13.8、20.6 mg。经过HPLC 分析并应用面积归一法测定1、2、3，3 个化合物的纯度分别为94.86%、94.28%和91.86%(分析结果见图3)。

3.3 化合物的结构鉴定

图2 萹蓄中黄酮类化合物的高速逆流图谱Fig.2 HSCCC chromatogram of flavone compounds from P.aviculare

化合物1 黄色粉末;FAB-MS(m/z):465(［M+H］+，100);EI-MS m/s(rel.int.%):318(100)，289(6)，149(6)，128(75)，113(28)，102(6)，85(14)，71(33)，58(82)。1H NMR(600 MHz，DMSOd6)，δ:6.88(2H，s，H-2＇，H-6＇)，6.37(1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，6.19(1H，d，J=1.8 Hz，H-6)，5.19(1H，br，s，H-1＇＇)，0.84(3H，d，J=5.4 Hz，H-6＇＇)。化合物1 的FAB-MS 和1H NMR 数据与文献［18］报道基本一致，故鉴定化合物1 为杨梅树皮苷。

图3 萹蓄中黄酮类化合物组分总样(A)、杨梅树皮苷(1)(B)、黄芪苷(2)(C)、desmanthin-1(3)(D)的HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of P.aviculare crude extract (A)，myricitrin (1)(B)，astragalin (2)(C)and desmanthin-1 (3)(D)

化合物2 黄色粉末;FAB-MS(m/z):447(［MH］-，100);EI-MS m/s(rel.int.%):286(100)，258(16)，213(9)，184(3)，121(25)，105(4)，93(8)，65(15)。1H NMR (600 MHz，DMSO-d6)，δ:12.61(s，5-OH)，8.03(2H，d，J=8.4 Hz，H-2＇，H-6＇)，6.87(2H，d，J=8.4 Hz，H-3＇.H-5＇)，6.42(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，6.19(1H，d，J=2.4 Hz，H-6)，5.45(1H，d，J=7.2 Hz，H-1＇＇)。化合物2 的FAB-MS和1H NMR 数据与文献［18］报道基本一致，故鉴定化合物2 为黄芪苷。

化合物3 黄色粉末;FAB-MS(m/z):615(［MH］-);EI-MS m/z(rel.int.%):318(65)，194(6)，170(29)，153(23)，126(100)，108(21)，97(9)，80(31)。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)，6.93(2H，s，H-2＇，6＇)，6.38(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，6.20(1H，d，J=2.4Hz，H-6)，5.48(1H，s，H-2＇＇)，5.47(1H，d，J=3.0 Hz，H-1＇＇)，0.84(3H，d，J=3.6 Hz，H-6＇＇)。化合物3 的FAB-MS 和1H NMR 数据与文献［18］报道基本一致，故鉴定化合物3 为合欢草素1。

4 结论

萹蓄中的黄酮类化合物在结构和性质方面非常相似，采用传统的硅胶柱色谱、高效制备液相、聚酰胺柱色谱分离纯化十分困难。本实验首先应用聚酰胺柱色谱法对萹蓄中的黄酮类化合物进行富集，然后采用HSCCC 对富集的黄酮类化合物进行分离纯化，得到3 个高纯度的黄酮类化合物杨梅树皮苷、黄芪苷、合欢草素1。该方法简便、快速、节省溶剂，具有较好的实用价值，为进一步开发利用萹蓄资源提供了一定的技术支撑。

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