黄芩素脂质体冻干粉的制备及初步评价

徐东伟 刘同祥

1.中央民族大学医院药剂科，北京 100081；2.中央民族大学中国少数民族传统医学研究院药物化学所，北京 100081

黄芩素（Baicalein）是黄酮类化合物，唇形科植物主要有效成分之一，具有抗菌、抗氧化，抗病毒、保肝利胆、抗肿瘤等广泛的药理活性，是一种具有很好应用前景的药物，目前临床上主要用于抗菌消炎及抗感染。但由于其水溶性与脂溶性较差，体内生物利用度低，限制了其临床应用[1-3]。

为了有效提高生物利用度，改善其口服吸收，将黄芩素制成脂质体，利用磷脂形成的脂质双分子层与生物膜相似，其具有良好的组织相容性和细胞相容性，囊泡包裹的药物分子也易被机体吸收，解决了脂溶性药物难溶于水的问题。不稳定的药物被脂质体包封后受到脂质体双层膜的保护，提高了易氧化药物在体内外的稳定性，具有生物降解性和生物相容性。本课题以脂质体作为药物载体，制备了黄芩素脂质体冻干剂，为黄芩素进一步拓展新剂型奠定了良好基础[4-5]。

1 仪器与材料

1.1 仪器

L-2000Elite型高效液相色谱仪（日立高新技术集团）；LGJ-10真空离心浓缩干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）；Mastersizer2000激光粒度测定仪（英国Malvern公司）；UV-9100型紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；EM-1400高衬度透射电子显微镜（日本电子公司）；RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；KQ-250B型超声波清洁器（昆山市超声仪器有限公司）；LD4-2A低速离心机（北京医用离心机厂）；AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；DF-101S恒温磁力搅拌器（郑州市亚荣仪器有限公司）。

1.2 材料

透析袋（美国联合碳化公司，截留相对分子质量8 000～14 000 D；批号：20141108）；大豆卵磷脂（上海太伟药业有限公司；批号：20141027）；黄芩素（西安瑞迪生物科技有限公司；纯度≥ 98%；批号：20140129）；胆固醇（中国医药集团上海化学试剂公司；批号：20140109）；Sephadex G-50（上海蓝季科技发展有限公司；批号:20141220）；吐温80（天津市永晟精细化工有限公司）；甲醇，乙酸，乙腈为色谱纯，其他试剂均为国产分析纯或药用。

2 方法与结果

2.1 黄芩素脂质体的制备

采用乙醇注入法制备黄芩素脂质体[6-7]。精密称取20 mg胆固醇、80 mg卵磷脂、2 mg黄芩素原料药于小烧杯中，加入5 mL无水乙醇，超声混匀。在涡旋条件下，将所得混合液用10.0 mL注射器以1 mL/min匀速注入55℃的10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）（pH=7.4，下同）溶液中，超声1 min后倒入小烧杯，加入转子，磁力搅拌器上慢速搅拌，除去乙醇（溶液体积小于10 mL），再次超声至体系均匀，得到黄色的带有淡黄色乳光的混悬液，过0.45 μm微孔滤膜，即得样品，4℃下保存，备用。空白脂质体除不加药物外，其他条件一样。

2.2 黄芩素的含量测定方法

精密称取黄芩素1 mg，置于10 mL量瓶中，用无水乙醇稀释得0.1 mg/mL储备液。取该储备液适量，用无水乙醇稀释成浓度分别为 1、3、5、7、9、11 μg/mL 的对照品溶液，并在276 nm处测定各溶液的吸光度值（A），以浓度（C，μg/mL）为 X 轴，吸光度（A）为 Y 轴进行线性回归，回归方程：A=0.1673 C－0.0624（r=0.9994），溶液在 1～11 μg/mL 线性关系良好。低、中、高浓度（1、5、11 μg/mL）的标准溶液日内、日间相对标准偏差（RSD）平均值分别为0.27%和0.55%（n=5）；低、中、高样品回收率分别为102.08%、99.16%和99.78%（n=3），均符合分析要求。精密吸取300 μL黄芩素脂质体至10 mL量瓶中，无水乙醇稀释至刻度，重复3次测定吸光度，代入标准曲线方程，计算得黄芩素脂质体的平均含药量为（0.20±0.03）mg/mL。

2.3 黄芩素脂质体的质量研究

2.3.1 脂质体的形态及粒径测定 取脂质体混悬液适量，用pH 7.4的PBS适当稀释，经激光散射粒度分析仪测定脂质体粒径及分布。结果表明，黄芩素脂质体粒度分布较均匀，平均粒径为（92.1±9.2）nm，多分散性指数（PDI）为0.238，粒径分布见图1。黄芩素脂质体混悬液为带有淡蓝色乳光的半透明黄色溶液。取脂质体混悬液液适量，pH7.4的PBS适当稀释后，用2%磷钨酸溶液负染，自然挥干，在透射电镜下观察脂质体形态并摄制照片，可见脂质体多为球形及类球形粒子，形态圆整，大小均一，见图2。

图1 黄芩素脂质体的粒径分布

图2 黄芩素脂质体的透射电镜情况

2.3.2 包封率的测定 采用柱层析法测定包封率，取适量充分溶胀的葡聚糖凝胶G-50，制备层析柱（200 mm×15 mm）；精密量取0.5 mL脂质体混悬液上柱，流速为0.5 mL/min，室温操作，以双蒸水洗脱，收集带有乳光的洗脱液，置10 mL量瓶中，用无水乙醇定容，涡旋混匀后，按“2.2”项下方法测定脂质体中包裹的药量W1；另取0.5 mL脂质体混悬液置10 mL量瓶中，同法操作，测定脂质体混悬液中的总药量W0[8-9]。按下式计算包封率（EE%）：EE%=W1/W0×100%。计算得3批脂质体的平均包封率为（82.9±1.4）%，RSD 为 0.82%（n=3）。

2.3.3 稳定性参数的测定 将制备好的黄芩素脂质体混悬液，取8 mL置于10 mL的EP管中，3 000 r/min离心20 min后，取下层溶液用无水乙醇适当稀释，以无水乙醇为空白，于276 nm处测定吸光度A0。另取未离心的脂质体混悬液同法稀释后测定A，计算稳定系数K（%）=（A0-A）/A0×100%，K 值越小，则体系的物理稳定性越好[10-11]， 反之则越差。结果重复3次，K为（0.1188±0.0300），K值较小，说明该法制备的黄芩素脂质体混悬液的稳定性较好。

2.4 药物体外释放研究

按照《中国药典》2010年版第3法采用透析袋法测定释放度[12-13]。分别取5 mL黄芩素脂质体混悬液（含黄芩素1 mg）和5 mL黄芩素溶液（0.2 mg/mL的乙醇溶液，含黄芩素1 mg）置透析袋中，扎紧两端，置锥形瓶，释放介质为含0.2%吐温80的磷酸盐缓冲液（pH=7.4）， 释放体积为 100 mL， 转速为 100 r/min，于（37±0.5）℃进行试验。在预定时间 0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24、36 h 取样 1 mL，同时补充等体积同温的释放介质。根据“2.2”项下方法，测量并计算各时间点黄芩素的释放量，以累积释放百分率为纵坐标，取样时间为横坐标绘制释放曲线。5 h内黄芩素原料药已经基本释放完全，而黄芩素脂质体释放不到50%，且释放速度小于原料药，36 h累积释放约80%，具有缓释效果。见图3。

图3 黄芩素脂质体和黄芩素原药的体外释放曲线

2.5 黄芩素脂质体冻干粉的处方优化

为了提高黄芩素脂质体的稳定性，筛选3种不同的冻干保护剂（甘露醇、葡萄糖和乳糖），在黄芩素脂质体混悬液中的浓度分别为3%、5%（W/V），将加有冻干保护剂的混悬液分装至西林瓶中，-80℃预冻12 h，后迅速转移至冷冻干燥机中冷冻干燥24 h即可。以外观、色泽、再分散性为主要评价指标，评分方法见表1，得分多者较佳，同一得分以辅料用量少者为佳[14]。综合指标分见表2，可见处方2分值最高，即用5%的甘露醇作为冻干保护剂制备得到的黄芩素冻干粉，外观饱满，色泽均一，再分散性好。

表1 冻干粉评分标准

表2 黄芩素冻干粉冻干保护剂的选择

3 讨论

本研究选择pH 7.4的磷酸盐缓冲液作为释放介质，由于黄芩素是水难溶性药物，具有较强的亲脂性，无法满足体外释放所需的漏槽条件，所以在释放介质中加入了表面活性剂0.2%吐温-80，促进其在释放介质中的溶解度。在体外释放过程分为两个阶段，突释阶段和缓释阶段，前者释放快的原因主要是来自未包封的游离药物，而以分子或细小粒子包载在脂质体中内相的药物，需要跨越磷脂双分子层，故而起到了缓释、长效的作用。

一般采用凝胶层析法测定柚皮素脂质体的包封率，但这种方法耗时长并使样品大量稀释而不利于药物含量的测定。柱层析方法由于离心力的作用，加快了脂质体和游离药物的洗脱速度，加之操作简单并可同时操作多份样品，大大缩短了测定时间。同时还有对样品稀释倍数小，减少葡聚糖凝胶用量，样品用量小等优点。

本实验为了降低脂质体粒子的粒径，通过薄膜分散后再经过超声处理，从而减小脂质体的粒径。另外由于其极小的粒径而具有的黏附性，比表面积大，使其易于黏附于肠壁上，增加了药物与肠壁的接触面积和接触时间，有利于药物吸收，增加了难溶性药物的生物利用度[15-20]。

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