不同形态纳米银的制备及其杀菌性能的研究

孙彩华 何佳奇 余朝辉

浙江中医药大学附属第一医院药剂科，浙江 杭州 310004

纳米银是一种新型材料，其杀菌能力强、杀菌广谱、应用安全，在杀菌领域有很大的应用价值。纳米银的形态有多种，已经发现的有球形、立方体、银纳米线、八面体、三角片等，其形态不同，则制备方法各异。传统的物理法不易控制条件，且费用较高，化学法操作简单且条件易控制[1-2]。其中微波法以操作简单、制备速率快等优点受到大量重视，本文以微波法制备不同形态纳米银，并对其杀菌性能进行研究。

1 纳米银的制备

1.1 材料

微波炉（Galanz G80F23CN1L-SD）、扫描电子显微镜（NOVANANOSEM 430）、透射电子显微镜（JEOL JEM-2100HR）、紫外-可见光分光光度仪（HACH DR 5000）、X 射线衍射仪（Bruker D8 ADVANCE）、电子天平（奥豪斯 AR2140）、高速离心机（中佳 HC-3017）。

1.2 仪器

硝酸银（AgNO3）（国药集团化学试剂有限公司）、聚乙烯吡咯烷酮 （PVPK30）（上海生物科技有限公司）、乙二醇（EG）（国药集团化学试剂有限公司）、氯化钠（NaCl）（广州化学试剂厂）、乙醇（广州化学试剂厂）、丙酮（国药集团化学试剂有限公司）、去离子水与超纯水为实验室（浙江中医药大学附属第一医院实验室）自制。

1.3 制备方法

利用微波合成法制备纳米银的步骤如下：在50 mL聚四氟乙烯反应容器中加入经准确称取的AgNO3、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、EG以及NaCl，可见在加入NaCl后溶液由澄清透明状逐渐变浑浊，溶液泛白、透光性变低，表示反应中产生了不溶于水的AgCl；充分搅拌溶液后获得纳米银溶胶；溶液经分离、洗涤后得到目标产物纳米银[3]。制备过程中设定的变量分别为NaCl的投入量（NaCl加入量设置为 0、0.05、0.1、1、5 mg）、反应条件（微波炉320 W加热，加热时间为30 min）、反应的时间（1.5～4 min）、PVP/AgNO3比例（0、2∶1、8∶1），对不同条件下制备的纳米银产物进行分析。利用X线衍射确定物相，区分纳米银的形态；利用紫外-可见光分光光度计区分银纳米线，判定银纳米线的产率及线粒比；利用电子显微镜观察产物的形貌，以确定晶体结构（单晶、孪晶或多晶）；通过红外光谱分析测定产物中是否存在有机物来判定纳米银清洗是否干净。

1.4 结果

1.4.1 不同NaCl加入量下的纳米银形态 对不同NaCl加入量所得的纳米银产物进行形态分析显示，反应体系中没有NaCl或NaCl加入量少时，得到的纳米银颗粒未见结构整齐、形态单一的准球形，其粒径为（60±10）nm；NaCl的量增加到0.1 mg时所得到的产物中不仅有准球形，还出现了立方体、右椎体、纳米棒等球形以外的结构；NaCl的加入量再增加后，所得到的产物中纳米颗粒所占的比例减少，银纳米线所占比例增加；将5 mg NaCl加入反应中所得到的产物中纳米银颗粒含量很少，而是以银纳米线为主，其线径为（60±10）nm，线长为 2～4 μm。

1.4.2 不同反应时间的纳米银形态 在反应溶液中不加NaCl时，随着反应时间的延长，所得产物的形态没有改变，均为准球形的纳米银颗粒，结构整齐、形态单一，粒径为（60±10）nm；而且紫外-可见光分光光度计扫描的结果显示，随着反应时间延长，所得产物的波长吸收峰没有改变，为430～440 nm，据文献[4]报道此吸收峰对应的是准球形纳米银颗粒，实验结果与报道相符；随着反应时间的延长，波长扫描特征吸收峰的吸收强度增高，说明所获得的准球形纳米银颗粒的量增加。

在反应溶液中加入5 mg NaCl溶液后，随着反应时间的延长，得到的产物不一样，在1.5 min时得到的为纳米银颗粒，其大小不一、形态不规则，表明纳米银生长阶段在初期；反应2 min时得到纳米银颗粒，颗粒粒径为（60±10）nm，形态以立方体为主，也有右椎体、准球体颗粒，还夹杂少许银纳米棒，表明出现了纳米银的完整结构；在时间逐渐延长到3 min时，银纳米线的产量增加，其产生的量与纳米颗粒的量一样多，测量线长为1～2 μm；反应时间到4 min时，产物中主要是银纳米线，仅有很少的纳米银颗粒，银纳米线的线长也延长到2～4 μm。通过紫外-可见光分光光度计波长扫描，随着时间的延长，吸收峰有变化，在1.5 min处的吸收峰为460 nm，吸收峰的强度稍低，因此处的吸收峰对应纳米颗粒的立方体，故此时纳米银颗粒还少；在反应到2 min时吸收峰为460 nm，此时的吸收峰强度很高，说明此时产物中主要是纳米银颗粒的立方体；反应时间延长到3 min时，有两个吸收峰，分别在390 nm处与460 nm处，而390 nm处代表银纳米线，表示此时纳米银颗粒与银纳米线的产量一样多；反应到4 min时，吸收峰为390 nm，即此时产物中主要含有银纳米线，结果如表1所示。

1.4.3 不同比例PVP/AgNO3时产物中纳米银的形态反应溶液中不加NaCl时，在不同比例的PVP/AgNO3反应体系中，得到的产物均为纳米银颗粒，在不加入PVP时产物中纳米银颗粒大小不规则，而在加入PVP后，产物中纳米银颗粒形状为准球形，大小均匀，形态规则，粒径为60～70 nm。

表1 不同反应时间下纳米银产物的分析

反应溶液中加入5 mg NaCl后，不同比例PVP/AgNO3反应体系中，得到的产物形态明显不同，反应液中未加PVP时，所得结果为纳米银颗粒，其形态不规则；加入PVP使得PVP/AgNO3比例为2∶1时，所得产物主要为纳米线；而加入更多PVP使得PVP/Ag-NO3比例为8∶1时，产物中主要是纳米颗粒，而纳米线的量很少，结果如表2所示。

表2 不同比例PVP/AgNO3时产物中纳米银的形态

2 不同形态纳米银的杀菌性能

2.1 仪器

2.1.1 仪器 96孔板（广州普博仪器有限公司）、电子天平（美国奥豪斯，AR2140）、高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司，HC-3017）、恒温振荡器（上海智诚分析仪器制造有限公司，ZHWY-2102C）、透射电子显微镜（上海日立高新技术国际贸易有限公司，H-7650）。

2.1.2 试剂 LB培养基、琼脂均购自广东环凯微生物科技有限公司；NaCl、碳酸氢钠（NaHCO3）、磷酸钠（Na3PO4）、硫化钠（Na2S）、硝酸（HNO3）均购自国药集团化学试剂有限公司；去离子水为研究组自制。

2.1.3 菌种及培养 大肠埃希菌 （E.coil）（广东省微生物所菌种保藏中心）在LB液体培养基上进行培养。

2.2 方法

2.2.1 测量纳米银的最低抑菌浓度 （MIC）采用对倍稀释法，把96孔板LB培养基中加入不同形态的纳米银（银立方体、银纳米线、准球形颗粒）与大肠埃希菌液，以2倍稀释法设定浓度，纳米银浓度设定为3～100 μg/mL，大肠埃希菌浓度为 1×103、1×104、1×105、1×106cfu/mL，将孔板放于37℃、200 r/min振荡器中培养24 h，判定 MIC。

2.2.2 测定纳米银的杀菌效果 把大肠埃希菌悬浮液中加入2 mmol/L NaHCO3缓冲液以1∶10的比例稀释，使得大肠埃希菌浓度为1×106cfu/mL，在离心管中以移液枪加入稀释后的细菌液，在加入3种形态的纳米银，将其浓度设定为 3、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL，并设置空白对照，对照组中未加入纳米银，其他成分则相同。样品反应时间为1 min，各取100 μL样品接种在LB培养基中培养24 h（放于37℃恒温摇床），查看大肠埃希菌生长情况。

2.2.3 透射电镜观察 通过透射电镜观察纳米银与大肠埃希菌的接触情况，步骤为：大肠埃希菌稀释液中加入纳米银，纳米银浓度为100 μg/mL，取一滴混合液经铜网固定2 min、滤纸吸去液体、经磷钨酸染色2 min后去掉多余染色液，在透射电镜下观察处理后的样品。

2.3 结果

2.3.1 不同形态纳米银的MIC 纳米银能抑制大肠埃希菌的生长，且随着大肠埃希菌浓度的增加，抑制其生长所需的纳米银的量增加，不同形态纳米银的MIC不同，银立方体形态纳米银的MIC最小，即抑制细菌生长的能力最强，准球形颗粒抑制细菌生长的能力次之，银纳米线MIC最大，即抑制细菌生长的能力最弱，结果如表3所示。

表3 不同形态纳米银的最低抑菌浓度（μg/mL）

2.3.2 纳米银的杀菌效果 将大肠埃希菌中加入不同形态纳米银进行培养的结果中，随着纳米银浓度的增加，对大肠埃希菌的抑制作用增强，3种形态纳米银对大肠埃希菌抑制能力不同，银立方体的浓度为25 μg/mL时即能灭活大肠埃希菌，而准球形颗粒浓度为100 μg/mL时使大肠埃希菌灭活，银纳米线浓度超过100 μg/mL时仍不能完全灭火大肠埃希菌，可见银立方体的灭菌效果最优，银纳米线灭菌效果最差，准球形颗粒介于两者之间，结果如图1显示。

图1 不同形态纳米银培养皿中大肠埃希菌培养情况

2.3.3 不同形态纳米银与细菌混合后投射电镜观察结果 大肠埃希菌中没有加入纳米银时，透射电镜下观察到大肠埃希菌表面并无多余的杂质，其表面光滑、平整。在大肠埃希菌液中加入3种形态的纳米银后，大肠埃希菌表面不平整，吸附着不同形态的纳米银。透射电镜显示3种形态的纳米银与细菌的接触情况不同，银立方体与大肠埃希菌能有效接触，两者接触面积大；球形纳米银能与大肠埃希菌有效接触，两者的接触面积亦很大；银纳米线不能与大肠埃希菌有效接触，两者的接触面积小。

3 讨论

纳米银的制备方法大体分为物理方法、化学方法、生物方法[5]。物理法是把较大的单质银以物理学方法制备成纳米大小的纳米银，有机械球磨法、蒸发冷凝法、雾化法等。其中机械球磨法的产物主要是纳米银颗粒，颗粒分布不均，纯度低。据有关报道，低温高能机械球磨法制备出了平均粒径为20 μg的纳米银颗粒；蒸发冷凝法能够制备清洁界面纳米银粉，有报道利用气象冷凝法得到了悬浮的纳米银粉；雾化法的产物为粉剂，有报道利用雾化法制备出超细颗粒，粒径在5～20 nm[6-7]。化学法是利用化学反应原理把银离子还原成单质银，有化学还原法、微乳液法、溶胶-凝胶法等。其中化学还原法以水或有机溶剂将金属盐溶解，再通过还原剂或表面活性剂使粒子结晶后脱水，制备得到粉体，制备的成本低、产量大，条件易控制，可制备出5～30 nm大小的纳米银粒子；微乳液法是使两种不相溶的溶剂混合成乳液，再从中析出固体成分，制备到纳米粉体，制备到的纳米颗粒多为球形，可制备6 nm的纳米颗粒，粒径均一；溶胶-凝胶法是利用特殊方法水解金属化合物为溶胶、凝胶，然后处理得到纳米粉体，产物粒度小、纯度高[8-9]。生物方法是将生物材料天然合成纳米微粒，采用的生物材料有龙眼叶、山茱萸、芳樟叶、栀子干粉、茶叶等，以其诸多优点而成为近年来研究的热点。鉴于纳米银的制备方法有多种，粒子形态也各异，且不同形态的纳米银性质和杀菌性能不同，近年来的研究中提出了纳米银形貌的可控制备方法[10-11]。

20多年来，不同形态纳米银的制备有了很大发展，新的制备方法也克服了传统方法中价格昂贵、纯度不高等缺点，其中微波法以其操作简单、制备速度快、产量多等优点而备受关注，本研究借用前人的研究成果，并结合本研究组多年的研究经验，通过控制微波法制备纳米银的条件来得到不同形貌的产物，对研究结果的分析如下：

首先，制备不同形态的纳米银是在热力学与动力学中改变制备的条件来完成的，且沉淀性离子是考虑的条件之一，Cl-能通过控制使Ag+形成沉淀的速率来调控反应的速率，而且Cl-通过与氧气结合来控制对晶种的选择，据此笔者研究不同NaCl的量对纳米银形态的影响，没有NaCl或少量NaCl时产物中以准球形纳米银颗粒为多，随着NaCl量增多，非球形产物比例增加，球形颗粒比例减少，NaCl增加到5 mg时产物以银纳米线为多，可见控制Cl-的量能够实现对纳米银形态的控制[12-13]。

其次，由于纳米银晶体的生长是按照成核-聚集-生长过程进行的，反应时间的长短不同则纳米银形态亦不同。本研究通过控制微波中的反应时间发现，在反应时间为1.5 min时，产生不规则的纳米银颗粒，随着时间的推延，产物中混有更多形态的纳米银颗粒，并逐渐出现纳米银棒，时间更长时产生长度更长的银纳米线，而纳米银颗粒的量逐渐减少，因此通过控制反应的时间能调控纳米银颗粒和银纳米线的制备[14]。

鉴于PVP具有的空间位阻特性，能够影响纳米银的分散性，控制纳米银的异性生长，据此考虑PVP加入量不同时对产物形态的影响，本研究在不加入PVP时得到不规则的纳米银颗粒，加入适量的PVP制备的产物以银纳米线为主，加入大量PVP时主要产生纳米颗粒，可见PVP的加入量能够影响纳米银的形态[15]。

纳米银是新型的杀菌材料，其杀菌效果强、广谱且应用安全，在杀菌领域具有不可估量的应用价值，查阅相关报道，分析其杀菌机制为：银能够紧密地结合含硫或含磷的化合物，而在细胞膜上存在含硫的蛋白质，纳米银结合硫蛋白后能够吸附在细胞膜表面并累积于此，也可以穿透细胞膜抵达细胞内部。相关研究也证实纳米银对细菌的杀灭作用是物理接触与化学反应共同作用完成的[16]。纳米银与细菌的物理接触是限制性步骤，一旦接触就会吸附在细胞膜表面，纳米银与细胞膜表面的含硫蛋白结合并反应，导致细胞膜功能受损，通透性改变，细胞随即死亡，因此，纳米银对细菌有抑制作用的重要机制是纳米银能够直接接触细菌表面[17]。

鉴于不同纳米银的性质不同，其杀菌能力也有强弱差异，本次研究中为比较不同形态纳米银的杀菌能力，制备了银立方体、准球形颗粒、银纳米线3种形态纳米银，结果显示不同形态纳米线的杀菌性能有差异，比较3种形态纳米银的MIC，银立方体的MIC最小，即杀菌效果最好，准球形颗粒的MIC稍高，其杀菌效果稍弱，而银纳米线的MIC最高，亦即杀菌效果最弱[18-20]。通过透射电镜观察，分析不同形态纳米银的杀菌性能强弱不同的原因，是由于纳米银形态能够影响其与细菌的接触面积，银立方体与球形颗粒能充分暴露接触面，接触更多的细菌，故杀菌性能强，而银纳米线的一维结构减少了暴露面积，其杀菌性能相对弱。对于银立方体与准球形颗粒为何表现出不同的杀菌效果，就需要用纳米银的晶体结构来解释，现已经明确银立方体表面主要覆盖{100}晶面，准球形颗粒表面主要覆盖{111}晶面，而γ{100}的表面能比γ{111}的表面能大，所以银立方体的反应活性更强，而具有较为稳定的{111}晶面结构的准球形颗粒反应活性稍弱，根据资料结果本研究推测，银立方体的杀菌性能比准球形颗粒的杀菌性能强是因为银立方体暴露有{100}晶面，反应活性比暴露{111}晶面的准球形颗粒强。

综上所述，不同形态的纳米银其制备流程不同，在微波法制备纳米银过程中，改变反应中所加NaCl的量、反应的时间、反应中PVP的量均能影响产物中纳米银的形态，据此，本研究可通过控制制备纳米银的材料或条件探究各种形态纳米银的最佳制备条件，来实现不同形态纳米银的可控制备。纳米银的形态不同则性质不同，导致其与细菌接触的有效面积大小也不同，则对细菌的灭活效果不同，本次研究的结果提示银立方体的杀菌性能比准球形颗粒强，准球形颗粒的杀菌效果又优于银纳米线，而对于改变杀菌试验中某一条件时对杀菌效果的影响，还需要进一步的研究加以证实。

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