内皮素-1和肿瘤坏死因子-α在急性低压缺氧大鼠肾组织中的表达和意义

牛天慧 郭广进 陆承荣 罗 渊 王 喆

空军总医院临床航空医学中心实验室，北京 100142

近年来，国内外对航空生理环境影响飞行人员的相关疾病机制研究取得了一定进展[1-3]。随着高性能战机的使用，使飞行人员面临高空气压损伤或缺氧等生理极限的挑战，为航空医学提出了新的研究课题。初次进入高原的人员在意外情况下也会遭受高原缺氧环境的影响，可引起胸闷、头痛、头晕、恶心、呕吐等高原反应[4]。在急性低压缺氧环境下肾是最易受到损伤的器官，有研究显示急性低压缺氧可引起大鼠肾功能和肾脏结构的变化[5-7]，可造成大鼠体内血清肌酐、尿素、碱性磷酸酶显著上升，肾小球滤过率明显下降。电镜下可见肾小球、肾小管、线粒体有病理变化。研究还发现急性低压缺氧可引起大鼠肾组织发生氧化损伤，使肾组织中清除自由基的酶 [如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化酶（CAT）]活性降低，造成自由基大量堆积，导致其结构损伤和功能障碍，从而进一步证实了自由基氧化性损伤是引起肾损伤的原因之一[8]。

急性低压缺氧对肾脏的病理损伤，是否通过内皮素-1（ET-1）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子的表达或是通过其他途径损伤尚不清楚。为此，本实验通过观察ET-1和TNF-α在急性低压缺氧大鼠肾组织中的表达情况，进一步阐明肾损伤的机制，为探讨有关防护措施的效果提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及实验环境

选择SPF级雄性Wistar大鼠16只，体重（200±20）g，由军事医学科学院实验动物中心提供，动物合格证号：[SCXK（军）2012-0004]。动物饲养在大鼠独立通风换气笼（IVC）系统内，使用许可证号：[SYXK（军）2012-0010]。饲养环境严格控制，温度20～25℃，日温差≤3℃，湿度40%～50%，空气洁净度10 000级，14 h黑暗，人工光照照明（8∶00～18∶00），饲喂 SPF 鼠料，饮用无菌过滤水。

1.2 仪器与试剂

小型动物低压舱由空军航空医学研究所研制；UV-2201紫外分光光度计由日本岛津公司生产；高速冷冻离心机由上海安亭科学仪器厂生产；速眠新Ⅱ由吉林省华牧动物保健品有限公司提供（批号：130412）；盐酸氯胺酮注射液由上海第一生化药业有限公司提供（批号：H31021897）；ET-1多克隆抗体和TNF-α单克隆抗体购于北京邦定公司；SOD、CAT和MDA试剂盒购于南京建成生物工程研究所；聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、山羊血清、二抗、二氨基联苯胺（DAB）、PBS缓冲液和苏木素染液购于北京中杉金桥生物技术公司；过氧化氢、甲醇和二甲苯购于北京化工厂。

1.3 动物模型建立

Wistar大鼠适应性饲养1周后，用完全随机法，采用实验对照方式，进行纵向观察研究。将Wistar大鼠随机均分为地面组和8.0 km组，每组各8只，参照尹世敏等[9]方法进行急性低压缺氧实验。将Wistar大鼠暴露于模拟海拔8.0 km低压舱内30 min，造成缺氧。然后以30 m/s的速度下降至地面，制成大鼠急性低压缺氧模型。地面组在另一低压舱内30 min不进行低压缺氧，同时观察大鼠行为状态。整个实验设计符合实验动物福利和伦理要求。

1.4 标本收集

所有动物均用速眠新Ⅱ与氯胺酮复合麻醉开腹，从腹主动脉取血5 mL分别放入非抗凝管中，以3000 r/min离心15 min，分别提取血清用于SOD、CAT活性和MDA含量测定；同时取每组大鼠左肾组织，用于免疫组织化学检测。

1.5 免疫组织化学检测方法

参照周敬等[10]采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法（streptavidin peroxidase conjugated method，SP法）检测各组大鼠肾组织ET-1和TNF-α的表达。第一抗体选用ET-1多克隆抗体和TNF-α单克隆抗体。取各组大鼠肾组织，石蜡包埋切片，厚2 μm，烤片2 h，常规脱蜡至水，PBS冲洗，5 min×3次，加0.1%Triton X-100常温下处理10 min，3%过氧化氢-甲醇溶液处理 15 min，PBS 冲洗，5 min×3 次，10%的山羊血清封闭15 min，分别加ET-1多克隆抗体和TNF-α单克隆抗体孵育，4℃过夜；PBS 冲洗，5 min×3 次，16 h后加二抗，37℃处理 30 min；PBS 冲洗，5 min×3 次，DAB显色，苏木素复染，经二甲苯透明后中性树胶封片。组织染成黄褐色为阳性。应用北京航空航天大学病理图像分析系统进行分析，随机计算每例切片20个不重叠的200倍视野中阳性细胞的平均吸光度，平均吸光度表示在视野内所有阳性细胞的平均反应强度，其中染色阳性细胞占观察细胞总数的比例即为阳性表达率。

1.6 生化指标检测方法

按南京建成生物工程研究所测定试剂盒说明检测各组大鼠血清中的SOD、CAT活性和丙二醛（MDA）含量。

1.7 统计学方法

采用SPSS 10.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠行为状态

8.0km缺氧组实验开始后大鼠自由活动，精神正常，5 min后逐渐转为精神欠佳，少动；10 min后出现洗脸样动作，抓挠躯体及四肢皮毛，表现烦躁、兴奋，对声音及敲击舱壁有警觉；随着缺氧程度的加深，大鼠逐渐变得安静，眼睛闭合，呼吸急促，幅度减低，蜷缩不动，出现紫绀，对声音及敲击舱壁无反应。提示低压缺氧时大鼠可通过一系列适应性、代偿性反应对抗低压缺氧的刺激。实验结束后，出舱大鼠无一例死亡。地面组在实验过程中活动、精神状态良好，无异常反应。

2.2 免疫组织化学检测结果

急性低压缺氧后经SP法免疫组织化学染色检测，8.0 km组与地面组比较，8.0 km组ET-1和TNF-α的阳性表达明显增强（图1）。与地面组比较阳性表达率明显增高，具有显著性差异（P＜0.05）。见表1。

图1 肾组织ET-1和TNF-α免疫组化结果（SP法，400×）

表1 两组大鼠肾脏ET-1和TNF-α免疫组织化学表达结果（%，）

表1 两组大鼠肾脏ET-1和TNF-α免疫组织化学表达结果（%，）

注：与地面组比较：*P ＜0.05；ET-1：内皮素-1；TMF-α：肿瘤坏死因子-α

组别 只数 ET-1 TNF-α地面组8.0 km组88 0.11±0.06 0.27±0.01*0.07±0.05 0.25±0.06*

2.3 大鼠血清SOD、CAT活性和MDA含量变化

急性低压缺氧后经SOD、CAT活性和MDA含量测定，8.0 km组与地面组比较，8.0 km组大鼠血清中MDA含量明显增高 （P＜0.05），SOD和CAT活性变化不大。见表2。

表2 大鼠血清SOD、CAT活性和MDA含量的变化（）

表2 大鼠血清SOD、CAT活性和MDA含量的变化（）

注：与地面组比较，*P＜0.05；SOD：超氧化物歧化酶；CAT：过氧化氢酶；MDA：丙二醛

SOD（NU/mL） CAT（μ /mL） MDA（nmol/mL）地面组8.0 km组组别 只数88 25.90±4.48 26.59±2.23 13.80±0.64 11.40±1.22 1.95±0.37 3.77±0.73*

3 讨论

高空缺氧是航空航天生理学中一个重要课题，至今仍是影响航空飞行安全的一个重要因素。依据急性高空缺氧的症状表现，将高度超过7.0 km的高空定为危险区，暴露在此高度机体的代偿反应已不足以保证重要器官的最低氧需要量，很快即出现多个系统功能的严重障碍，对飞行员和航天员的飞行安全构成严重威胁。因此，应用小型动物低压舱开展急性低压缺氧的研究具有重要意义。小型动物低压舱具有结构简单、成本低、实用、稳定的特点，为开展航空医学、高原医学研究提供了一种实验平台。

关于急性低压缺氧引起肾损伤的机制多数认为与氧化应激有关。氧化应激可引起活性氧、自由基在体内增多，最终导致机体氧化和抗氧化失衡及氧化损伤[11-13]。在正常情况下，体内清除自由基的酶（如SOD、CAT）可有效清除并抑制细胞中多余自由基的生成，以维持体内自由基的平衡。自由基的产生使生物膜脂质过氧化而产生MDA，MDA含量可直接反映出细胞氧化应激损伤的强度和速度。本实验通过测定大鼠血清中SOD、CAT活性和MDA含量的变化，发现急性低压缺氧所引起氧化应激反应的程度不同。在急性低压缺氧后，血清MDA含量升高，反映体内的脂质过氧化反应明显增强，但SOD和CAT活性变化不明显。其原因可能是30 min缺氧程度比较轻，抗氧化损伤也比较轻，再加上机体抗氧化系统的初步动员使自由基得以清除，这与常耀明等[14]的研究结果一致。同时也不能排除存在其他潜在的抗氧化物质。

急性低压缺氧对肾脏的病理损伤，是否通过其他途径损伤尚不清楚。基于此假设，本实验对急性低压缺氧肾组织内ET-1和TNF-α的表达情况进行了初步探讨。ET-1是主要由血管内皮细胞合成与分泌的一类缩血管活性肽，由21个氨基酸组成，其对肾血管的缩血管效应比其他血管还强[15]。动物实验证实急性低压缺氧环境中肾小球细胞、肾小管上皮细胞均会受到损伤，使肾小球产生ET-1明显增多，导致肾小球大量释放血小板激活因子（PAF），PAF可直接引起肾小球通透性的改变和肾小球膜上皮收缩。本实验中ET-1阳性表达率明显强于地面组，说明局部ET-1浓度的升高可使缺氧缺血区血管产生强烈而持久的收缩，从而加重缺氧缺血性肾组织损伤。TNF-α是主要由单核-巨噬细胞以及肾脏的内皮细胞、肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞等多种细胞所产生的一种重要细胞因子[16-17]，在炎症介导的过程中起着重要作用。TNF-α既是重要的炎症介质，又能参与组织损伤后的修复和重建[18]。TNF-α大量表达后，可直接对肾组织产生毒性作用，导致细胞凋亡，进一步加重肾脏损伤。本实验中TNF-α阳性表达率明显强于地面组，说明TNF-α直接损伤肾小管上皮细胞和肾小球内皮细胞，促进炎性反应。

综上所述，ET-1和TNF-α可引起急性低压缺氧应激条件下肾脏的病理损伤，可能与肾脏病理损伤密切相关，可作为反映缺氧性肾损伤程度的重要指标。通过对肾脏病理损伤机制的研究可以评价药物对缺氧机体的保护作用，已有研究显示一些中草药具有抗缺氧作用[19-21]。相信随着急性低压缺氧应激条件下肾损伤机制研究的不断深入，将为探讨有关防护措施提供更加坚实的理论基础。

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