从功能部件看小干扰RNA表达载体的发展

侯莹孙西魁唐明青，2

（1.华侨大学生物医学学院&分子药物研究院，泉州 362021；2.分子药物教育部工程研究中心，厦门 361021）

从功能部件看小干扰RNA表达载体的发展

侯莹1孙西魁1唐明青1，2

（1.华侨大学生物医学学院&分子药物研究院，泉州 362021；2.分子药物教育部工程研究中心，厦门 361021）

RNA干扰作为转录后基因沉默的有效途径，在基因调控、功能分析及疾病防治等领域发挥重要作用。小干扰RNA表达载体的诞生实现了RNA干扰技术持续、稳定和可控性应用，是实现基因沉默的理想选择。目前干扰性小RNA表达载体虽已发展到第二代，也开发出多种商品化的产品，但依然未能很好地解决其高效、安全、可控性方面的矛盾，发展陷入了瓶颈期。因此，从载体自身角度出发，通过系统分析其功能部件的特点，纵观小RNA载体的历史渊源、发展现状、存在问题和发展方向等问题，为干扰性小RNA表达载体的优化与选择提供相关理论指导。

小干扰RNA；表达载体；表达元件；短发夹式RNA载体；人工微小RNA载体

RNA干扰（RNA interference，RNAi）作为生物界普遍存在的一种抵御外来基因感染的保守机制，本质上是一种由内源性或外源性双链RNA（double strand RNA，dsRNA）引起的靶基因特异性沉默效应（gene silence），已被广泛应用于基因敲除、基因调控、功能分析和疾病防治等方面，并在基因治疗（gene therapy）中崭露头角［1-4］。能引起RNAi效应的分子称为干扰性小RNA分子（interfering small RNA），多为19-29个核苷酸（nt）的非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA），主要包括小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）和piwi蛋白RNA（piwi interacting RNA，piwi-RNA）几类，是RNAi效应的最终“执行者”。

目前，干扰性小RNA分子的产生主要依赖于化学合成（chemical synthesized）和载体表达（vector expression）两种途径。前者由于体外合成错误率高、体内稳定性差、成本高及后续操作条件苛刻等原因，极大的限制了其在现代生物学中的应用和发展；而干扰性小RNA的载体化表达，即将目的小RNA嵌入特定的载体中进行表达，能很好的弥补化学合成型小RNA的诸多不足，有望实现长效、安全、可控性表达，为个体化及靶向性基因治疗奠定了基础［5］。当前干扰性小RNA表达载体虽然已经发展到第二代，也开发出了多种商品化的产品，但依然未能很好的解决其高效、安全、可控性方面的矛盾，发展陷入了瓶颈期。因此，本文从载体自身角度出发，通过系统分析其功能部件的特点，纵观小RNA载体的历史渊源、发展现状、存在问题和发展方向等问题，为干扰小RNA表达载体的优化与选择提供相关理论指导。

1 功能部件

干扰性小RNA表达载体是一类经济、高效的载体，由启动子（promoter）、表达骨架（expression backbone）、目的小RNA序列及辅助元件（auxiliary component）组成。在实际元件组装中，先将目的小RNA序列插入表达骨架后形成小RNA表达框，随后在表达框的上下游分别加入相应的启动子和辅助元件而形成完整的干扰性小RNA表达载体。因此，小RNA表达框的确定是整个干扰性小RNA表达载体构建的核心部分。目前主要通过化学合成和PCR法来获取目的小RNA表达框［6，7］，前者适用于较短小的小RNA表达框，而后者适于长片段的小RNA表达框［5，8］。

表1 三类干扰性小RNA表达载体的对比分析

1.1 启动子

启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶（RNA polymerase）结合并促进起始RNA合成的序列，是基因表达不可缺少的元件。用于干扰性小RNA表达载体的启动子主要为RNA聚合酶Ⅲ启动子（PolⅢ）及RNA 聚合酶Ⅱ启动子（Pol Ⅱ）两类（表1）。前者如U6和H1，具有固定的起始位点，遇到4-6个连续的胸腺嘧啶（T）即终止转录，能高效、精确地合成目的小RNA序列，但此类启动子不宜携带较大片段的报告基因或其他功能性基因，同时缺乏组织特异性，且易产生脱靶效应（off-target）和细胞毒性（cytotoxicity），目前主要用于siRNA的载体化表达［5，6］。而PolⅡ启动子如CMV和CAG等，无固定的启动位点，启动能力强，可携带大片段的报告基因或其他功能性基因亦不会因少数连续的胸腺嘧啶而终止转录，因此更有利于实现靶向性和可控性表达，广泛用于内源性miRNA及人工miRNA（artificial miRNA，amiRNA）的载体化表达［9，10］。

1.2 表达骨架

表达骨架由具有发夹结构（hairpin structure）的小RNA分子模板及侧翼序列（flanking sequence）构成。其中发夹结构由正义链（sense strand）、反义链（antisense strand）及连接两部分的套索结构（lariat）组成，是目的小RNA序列能否成功表达的决定性因素［5，11］。研究发现，通过模拟内源性miRNA分子的骨架结构，能够有效避免外源性目的小RNA在体内表达时所产生的细胞毒性及对内源性miRNA通路的干扰作用［20］，amiRNA表达骨架则采用此种方法构建。课题组前期研究亦表明，不同表达骨架对相同目的小RNA序列的表达效率最高可相差3个数量级，同一表达框对不同目的小RNA序列的表达效率最多相差近150倍，而且不同种属来源的表达框在相同宿主中表达效率相差多达82倍。这不仅体现了表达骨架对干扰性小RNA表达载体的决定性作用，更暗示了其与目的小RNA序列、宿主起源之间的密切关系。鉴于此，今后的研究更应注重表达骨架的结构和进化关系上的问题。

1.3 目的小RNA序列

与常见蛋白基因表达载体不同，干扰性小RNA表达载体中的目的序列主要为长约20 bp的非编码序列，其本质是特定mRNA分子的反向互补序列。目前常见的小RNA序列主要有siRNA、amiRNA和miRNA三种，前两种可先借助软件设计获取理论上的干扰性小RNA序列，再通过功能性实验最终获取目的干扰性小RNA序列［14］，而后者主要参考miRNA文库（miRNA database），如miRbase［12，21］。

1.4 辅助元件

成功构建一个干扰性小RNA表达载体除了具有上述主要元件外，还需要其他元件的辅助，如报告基因（reporter gene）、增强子（enhancer）、终止子（terminato）等。报告基因是整个实验操作的指示剂，如绿色荧光蛋白（green fluorescent proteins，GFP）、增强绿色荧光蛋白（enhance green fluorescent proteins，EGFP）、β-半乳糖苷酶（LacZ）、荧光素酶（fluc）等［5，15］，由于这些报告基因都是近1 kb的大片段，目前大多局限应用在pol II启动子所在的干扰性小RNA表达载体中。增强子是用来增强启动子工作效率的顺式作用元件，能有效促进目的小RNA的转录，常用的有SV40［22］、Ago2［8］等。终止子是小RNA序列转录的终止序列，常用的有TTTTT（T）序列［23］和SV40polyA序列［24］。前者仅限用于Pol III启动子所在的干扰性小RNA表达载体，而后者则多见于Pol II启动子所在的干扰性小RNA表达载体。

2 发展趋势

第一个干扰性小RNA载体pSUPER的诞生让人们看到了干扰性小RNA载体化表达的重要性和优越性［6］。随后，干扰性小RNA载体迎来了5年的黄金发展期，各种标志性的干扰性小RNA载体相继被报道［5，17，18］，但近几年却未见革命性突破。目前，人们根据干扰性小RNA载体中表达骨架和目的小RNA的不同，将RNA表达载体分为短发夹式RNA载体（short hairpin RNA vector，shRNA vector）、内源性miRNA载体（miRNA vector）和人工合成miRNA载体（artificial miRNA vector，amiRNA vector）3大类（表1）。不同类别的载体不仅反映了其自身结构特性的差异，同时也体现了不同的历史渊源。shRNA载体作为早期干扰性小RNA载体的代表，其衍生产品早已被广泛应用。而amiRNA载体则代表了干扰性小RNA载体发展的第二个重要时期，正日益受到人们青睐。当然，miRNA载体作为amiRNA载体的模拟对象，一直是amiRNA载体诞生和改进的源泉与动力。

2.1 shRNA载体

早在2002年，研究者将目的siRNA序列嵌入至短发夹式小RNA表达骨架中，成功实现了干扰性小RNA的载体化表达，构建了第一个shRNA表达载体［5］。shRNA表达载体的诞生开启了RNAi载体化的先河，给小RNA的表达带来了一个全新的突破。因此，shRNA载体亦被称为第一代干扰性小RNA表达载体。

shRNA载体的表达骨架由两段反向互补排列的核苷酸序列及一小段用于形成茎环结构的间区组成，能转录产生一个具有紧密发夹环（tight hairpin turn）结构的RNA序列。随后，转录产物流向siRNA发生途径，在胞内Dicer酶的作用下直接加工成目的siRNA，发挥特异性抑制靶基因的作用，因此能产生高效率的基因沉默现象［5］。与传统的化学合成型siRNA相比，shRNA表达载体时效性更长，成本更低，较少量的shRNA表达载体即可产生良好的抑制效果（表1），被广泛应用于个体及系统性基因调控研究和RNAi文库（RNAi library）的建设。

由于shRNA载体主要采用Pol III启动子和TTTTT（T）终止子进行目的小RNA序列的转录，不能进行组织特异性调控，也不宜携带报告基因或其他功能性基因，这很大程度的影响了其在现代基因治疗中的应用前景（表1）。同时，随着研究的深入，shRNA载体的其他诸多缺陷也开始引起人们的重视，如存在脱靶效应［17］、易产生细胞毒性和干扰内源性miRNA通路［21，25］等问题（表1）。鉴于此，后续的研究主要集中在载体结构优化上，以期实现shRNA载体高效、安全、特异性表达。Schopman等［11］通过优化载体中发夹环的序列、结构和大小，成功设计了靶向HIV-1基因的高效shRNA表达载体，使对靶基因的抑制率提高到原来的7倍；Chumakov等［26］在优化茎环结构的基础上同时实现了多目的小RNA序列的串联表达，并采用不同种Pol Ⅲ启动子分别调节，大大提高了siRNA的表达率及对靶基因的抑制率。

2.2 miRNA载体

miRNA表达载体作为一类高效、低毒的表达载体，主要通过Pol II或Pol Ⅲ启动子完成内源性miRNA序列及其表达框的转录，形成的miRNA原始转录本（pri-miRNA）在核内经Drosha酶形成miRNA前体（pre-miRNA），出核后在胞质Dicer酶作用下形成成熟miRNA，发挥基因调控作用。但目前亦已发现存在不依赖于Dicer加工而直接由AGO2完成加工和功能链选择的miRNA（miR-451），且与恶性肿瘤的发生密切相关［27］。miRNA载体的研究主要集中于其携带的miRNA与疾病发生的关系，而非载体自身，是研究疾病发病机制的有力手段。Liang等［9］以miR-26a为基础构建了pHsa-miR-26a表达载体，并成功转染至人肝癌细胞，为进一步研究miR-26a在肝癌发生发展过程中的作用提供了有力手段；Yang等［13］以同样方法构建了miRNA-218表达载体，为抑制乳腺癌的转移提供了一种新的治疗策略。

2.3 amiRNA载体

在意识到shRNA载体可能存在内源性差的问题之后，Zeng等［17］尝试以人源miR-30a原始转录本（pri-hsa-miR-30a）为小RNA表达骨架，成功构建了能模拟内源性mRNA通路的干扰性小RNA载体，即amiRNA载体，第二代干扰性小RNA表达载体由此诞生。随后，Chung等［18］又以鼠miR-155原始转录本（pri-mmu-miR-155）为小RNA表达骨架，同样实现了目的小RNA分子长效、安全、可控性表达。目前，以pri-hsa-miR-30a和pri-mmu-miR-155为小RNA表达骨架的amiRNA载体是唯一被广泛认可和商业化的载体［28，29］。

amiRNA载体的表达框是由内源性miRNA前体衍生而来，长度远大于shRNA载体的表达框，因此采用Pol II启动子来完成其转录，转录产物在体内产生一个无须严格配对的茎环结构，随后在核内由Drosha酶作用转化为amiRNA前体（Pre-amiRNA），出核后在Dicer酶的作用下加工为成熟的amiRNA，发挥靶基因调控作用［26］。由于该过程模拟了内源性miRNA的发生途径［30］，因此与第一代干扰性小RNA载体相比，amiRNA载体具有组织特异性强、时间及沉默水平可控性好、毒性低、综合沉默途径效果佳等优点（表1），广泛用于基因功能研究和RNAi文库建设，是干扰性小RNA载体的未来发展趋势。

由于amiRNA载体在体内采用与内源性miRNA相同的发生通路，产生大量的异构小RNA序列（Iso-RNA）在所难免，存在靶点多、预测难、作用温和的缺点，不利于靶向性和个体化治疗研究（表1）。鉴于amiRNA载体在基因治疗中潜力的凸显，围绕如何提高amiRNA靶向性、表达效率及扩充载体使用范围的研究日益增多，期望建立更为高效、经济、适用范围更广的amiRNA载体。有研究者在商品化表达载体的基础上，对miRNA-30或miRNA-155前体结构进行改造，通过更换茎环结构保守区域的碱基，设计错配结构，改变限制性酶切位点等手段，以探究不同小干扰RNA分子二级结构对沉默效果的影响，以期望构建一个高效率的amiRNA载体［10，31］。Hu等［15］通过对表达骨架结构的成功改造，实现了单启动子操控多基因串联表达并同时沉默多个靶基因的目的，该方法经济高效，为amiRNA载体的构建提供了一种新的思路。在意识到amiRNA表达骨架具有明显的种属特异性及进化保守性后，研究者开始了不同物种及进化关系的miRNA前体的研究，陆续开发出以鼠miRNA-21原始转录本（primmu-miR-21）［19］、鸡miRNA-126原始转录本（pri-ggamiR-126）［32］及植物源的miRNA的原始转录本［7，33］为表达骨架的载体，均实现了目的小RNA的成功表达和靶基因沉默。不同种属miRNA原始转录本的成功开发，扩宽了amiRNA表达载体的应用范围，加快了RNAi基因药物的研发进程。

3 结语

RNAi干扰技术发展至今已成为较为成熟且应用最为普遍的基因调控策略，在基因治疗领域拥有较好的前景。但值得注意，风险与优势并存。shRNA载体潜在的脱靶效应及细胞毒性、amiRNA载体的表达效率及种属特异性等问题都极大限制了小干扰RNA表达载体的临床应用进程。课题组前期研究亦发现，现有的商品化载体对某些小RNA序列不仅表达效率低下，而且忠诚度不高。最近我们通过生物信息学、文库筛查、结构突变等方式已经获得了一种表达效率比市售商品高9倍的amiRNA载体（HD7），目前正在对HD7进行通用性和安全性的研究。

未来，相信随着对RNAi发生过程的进一步认识，会增强小干扰RNA表达载体的沉默效果并弱化脱靶效应，构建全基因组功能确认的RNAi文库，并靶向潜在的药物靶点，为基因治疗奠定基础。针对于此，未来的发展应侧重以下几个方面：（1）载体表达框的设计与优化，完善序列设计策略与工具，构建表达骨架与目的小RNA匹配程度较高的表达框，实现表达骨架、目的序列及受体细胞三者之间的完美匹配；（2）增强递送系统与表达系统的特异性，针对不同系统进行化学修饰，提高递送系统的靶向性，或开发新的递送系统和表达系统，增强表达载体的适用范围；（3）多种技术综合应用，如锌指核酸酶（ZFNs）、单倍体细胞插入诱变、成簇的规律间隔的回文重复序列（CRISPR）等技术将会互补基因沉默手段，扩展了解和解决人类疾病的使用工具，更好地促进人类基因组学的研究。

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（责任编辑 狄艳红）

Evaluating the Development of Small Interfering RNA Expression Vector from Its Functional Elements

Hou Ying1Sun Xikui1Tang Mingqing1，2
（1. School of Biomedical Sciences and Institute of Molecular Medicine，Huaqiao University，Quanzhou 362021；2. Engineering Research Center of Molecular Medicine，Ministry of Education，Xiamen 361021）

RNA interference as a potent gene silencing approach plays important parts in gene regulation， functional study and gene therapy. The small interfering RNA expression vector achieves a sustainable， stable and controllable application of the RNAi technology， and becomes a promising way for gene silencing. Although the interfering RNA expression vector has progressed to the second generation， and many commercial products were availabe， the discrepancies among efficiency， safety and controllability of these vectors still exist. The development of the interfering RNA expression vector seems get into a lag phase. Therefore， this article analysed the history and development of these small interference RNA expression vectors on the basis of their functional blocks， providing a theoretical fundation for the vector's optimization and selection.

small interference RNA；expression vector；expression component；short haipin RNA vector；artificial microRNA vector

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.009

2014-09-02

国家“863”计划项目（2012AA020810），国家自然科学基金项目（81271692），华侨大学“中央高校基本科研业务费”项目（JB-JC1004），华侨大学人才引进项目（14BS111）

侯莹，女，硕士研究生；研究方向：非编码RNA；E-mail：hy552014@163.com

唐明青，男，博士，副研究员，研究方向：非编码RNA，基因药物，病毒载体；E-mail： Tangmingqing2222@163.com