酒精性心肌病小鼠心电图校正QT间期延长的电生理机制探讨*

江宇，韩钟霖，曹克将，汪道武

基础与实验研究

酒精性心肌病小鼠心电图校正QT间期延长的电生理机制探讨*

江宇，韩钟霖，曹克将，汪道武

目的：通过建立酒精性心肌病小鼠动物模型，研究酒精性心肌病小鼠校正QT间期（QTc）延长的电生理机制。

方法：将40只C57 BL/6小鼠随机分为两组，酒精组（n=25）和对照组（n=15）。酒精组通过长期饮酒和灌胃建立小鼠酒精性心肌病模型，因造模和麻醉过程中死亡12只小鼠，最终纳入13只小鼠，对照组麻醉过程中死亡3只小鼠，最终纳入12只。使用染色和电镜验证酒精性心肌病模型，用小动物心电图测量小鼠心电图相关指标，通过酶解法将小鼠心室肌细胞进行急性分离，最后使用全细胞膜片钳技术对细胞动作电位以及各种离子通道进行电生理学检测，并进行通道相关动力学急性检测。

结果：5个月后，酒精组小鼠平均左心室射血分数（LVEF）值为（39.06±1.511）%，而对照组小鼠为（61.18±2.56）%。小鼠心电图检查显示，酒精组平均QTc较对照组明显延长[（106.43±5.91）ms vs （85.64±6.35）ms，P＜0.05]。全细胞膜片钳实验发现，酒精组小鼠心肌细胞动作电位时程延长，心肌细胞动作电位复极至90%所需时间（APD90）为（37.62±3.53）ms，对照组小鼠心肌细胞APD90为（25.77±3.41）ms。膜片钳实验发现酒精组小鼠L型钙电流失活延迟，其窗口电流面积增大。

结论：长期大量饮酒可导致心室肌钙通道失活延迟，从而延长心室肌细胞动作电位。这是酒精性心肌病小鼠心电图QTc延长的原因之一。

酒精性心肌病；校正QT间期；膜片钳实验；动作电位；L型钙电流

Methods: A total of 40 C57BL/6 mice were randomly divided into 2 groups: Alcoholic group, n=25, the ACM model was established by long term alcohol drinking and intragastric alcohol administration, 12 mice died during modeling and anesthesia and 13 mice were enrolled for study. Control group, n=15, the mice were fed by normal diet, 3 died during anesthesia and 12 were enrolled for study. All animals were treated for 5 months. The pathological changes of ACM were examined by electric microscope, QT interval was measured by ECG, the electrophysiology of cell action potential duration and ion channels were detected by whole cell patch-clamp techniques.

Results: Alcohol group showed decreased left ventricle ejection fraction (LVEF) than Control group (39.06 ± 1.511) % vs (61.18 ± 2.56) %, prolonged QT interval (106.43 ± 5.91) ms vs (85.64 ± 6.35) ms, P＜0.05, and extended action potential duration APD90(37.62 ± 3.53) ms vs (25.77 ± 3.41) ms. Alcohol group also presented delayed voltage-dependent inactivation of L-type Ca2+channel and increased window current area.

Conclusion: Long term alcohol drinking may cause extended inactivation of myocardium Ca2+channel, prolong the action potential duration, which is one of the mechanisms for prolonged QT interval of ACM in experimental mice.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:374.)

众所周知，校正QT间期（QTc）延长和离散增加与心律失常密切相关，QTc延长也是酒精性心脏病猝死患者中常见的现象之一[1-3]。这部分患者发生QTc延长的概率为22%～46.9%[4]。QT间期与动作电位时程（APD）的变化与心肌细胞离子通道功能相关，目前已有研究证明多种动物心肌细胞在急性酒精作用下可影响细胞APD。Williams等[5]发现，5分钟的酒精暴露即可下调家犬心脏蒲肯野纤维的APD。然而，相关研究多侧重于酒精对心肌离子通道的急性变化，这种变化并不能完全代表临床长期饮酒导致心脏结构及电生理重构的变化。由于目前关于慢性饮酒对心肌电生理的影响的研究尚不充分，因此本研究旨在慢性酒精性心脏病小鼠的基础上，观察并探讨小鼠QTc变化的机制，为今后的临床研究提供更多的理论依据。

1 材料与方法

酒精性心肌病小鼠模型的建立：2013-03至2014-09使用6周龄立特艾比拉特洛波C57BL/6清洁级小鼠[由扬州大学比较医学中心提供，动物合格证号：SCXK（苏）2012-0004]40只，适应性饲养一周后，随机分组，酒精组25只，对照组15只，两组小鼠平均体重无明显差异。参考Wei Liu等[6]大鼠酒精性心肌病造模方法，酒精组依次给予浓度为5%、10%酒精自由饮一周后，在10%酒精自由饮的基础上，以30%酒精灌胃0.2 ml/d，持续5个月造模（含酒精饮用水为唯一水源）。对照组以同等热量的葡萄糖水灌胃。

超声心动图结构及功能测定：在造模和麻醉过程中，酒精组死亡12只小鼠，最终剩余13只；对照组死亡3只，最终仅剩12只。使用小动物超声成像系统（Vevo770，Visual Sonics，加拿大）进行二维超声心动图检测，超声探头为RMV70型。计量资料连续测量5个心动周期取平均值。测量指标包括室间隔厚度（IVS）、左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率（LVFS）、左心室后壁收缩厚度（LVPW）。

心电图测量：造模5个月后随机从酒精组和对照组各取7只小鼠进行心电图测量（酒精组小鼠麻醉过程中死亡1只，仅剩6只），接通多道生物信号采集与处理系统（RM6240B，成都仪器厂，中国），用0.1 ml 10%的水合氯醛麻醉小鼠，3～5 min待小鼠安静后，取小鼠仰位，电极连线分为红色（E）右上肢、黑色（EB）右下肢、绿色（HB）左下肢（Ⅱ导），将针电极分别刺入其四肢皮下，记录Ⅱ导联的心电图。

心肌病理形态学、电镜和心肌胶原纤维染色：造模5个月后用断颈术处死3只小鼠，取出心脏，用4%甲醛固定，石蜡包埋，取左心室冠状面制备3 mm薄切片，苏木精-伊红（HE）染色和马松（masson）染色后显微镜下观察形态变化。另取1 mm×1 mm左右的组织，固定、脱水、包埋、切片、染色进行透射电镜（JEOL-1010，日本电子，日本）观察。

单个心室肌细胞的分离：酒精组和对照组各选用造模5个月的4只小鼠以1000 U/kg肝素皮下注射，断颈后，快速取出心脏，置于Langendorff灌流系统中，在37℃恒温下进行主动脉逆行灌流，流速3 ml/min。用台氏液[正常台氏液成分（单位mmol/L）：氯化钠140；氯化钾5.4；氯化钙1.8；氯化镁0.5；4-羟乙基哌嗪乙磺酸5.0；葡萄糖5.5；磷酸二氢钠0.4，酸碱度（pH）用氢氧化钠调至7.40]灌流1 min排除残留血液后，换无钙台氏液[为正常台氏液中不加钙离子]灌流5 min排出液体中钙离子，最后用含有0.05%胶原酶Ⅱ（Type 2，Worthington，美国）液体灌流12～15 min。取下心脏，将心室肌剪碎、吹打成单个心室肌细胞，自然沉淀，吸取上清液，用上述不含胶原酶的液体在室温下孵育10 min、在KB液（单位mmol/L：氢氧化钾70，氯化钾40，磷酸二氢钾20，L-谷氨酸50，牛磺酸20，乙二醇双四乙酸0.5，4-羟乙基哌嗪乙磺酸10，葡萄糖10，用氢氧化钾将pH调节至7.3）中孵育2 h后，选择其中纹理清晰、表面光滑的单个心室肌细胞进行膜片钳实验。

小鼠心室肌细胞膜片钳实验：全细胞记录单个心室肌细胞动作电位和钠电流、L型钙电流以及瞬

时外向钾通道电流。将细胞悬液滴于三维倒置显微镜（IX50，OLYMPUS，日本）工作台上的灌流槽内，待细胞黏附于槽底后，用细胞外液灌流，灌流速度l ml/min。玻璃微电极（1.4 mm，南京泉水电生理仪器厂，中国）用玻璃微电极拉制仪（P-1000 Model，Sutter Instrument，美国）拉制，电极灌冲内液后的电阻是1～3 MΩ，电极与膜片钳放大器（Axopatch 200B，Axon Instrument，美国） 相连，当电极尖端与细胞表面接触后，以持续负压吸引，使电极尖端与细胞表面形成高阻抗（1 G以上）封接，再以微小负压吸破细胞膜，计算机补偿快速膜电容，形成全细胞记录。在全细胞电流钳状态下记录到心室肌细胞的静息电位，然后给予脉宽3 ms、电流强度200～400 pA的刺激，即可诱发小鼠心室肌细胞动作电位的产生。测量心肌细胞动作电位复极至90%所需时间（APD90）；在全细胞电压钳状态下，用细胞外液灌流5 min，分别记录钠电流、L型钙电流以及瞬时外向钾电流及相关动力学指标。

2 结果

心电图结果：通过对小鼠Ⅱ导联的观察，发现酒精组（n=6）小鼠的心率、PR间期、RR间期和QRS间期与对照组（n=7）没有明显差异（P＞0.05），QTc延长有统计学意义（P＜0.05）。表1

心功能观察结果：5个月后，酒精组小鼠（n=13）LVEF和LVFS值均低于对照组（n=12），差异有统计学意义（P均＜0.05）。表2

表1 两组小鼠的心电图比较分析（

表1 两组小鼠的心电图比较分析（

注：与对照组比较*P＜0.05

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表2 两组小鼠心功能指标检测结果

表2 两组小鼠心功能指标检测结果

注：与对照组比较*P＜0.05。LVEF：左心室射血分数 LVPWd：左心室后壁厚度 IVS：室间隔厚度LVFS：左心室短轴缩短率

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心肌组织电镜、病理和心肌胶原染色结果：通过HE染色发现酒精组小鼠心肌细胞老化、缩小，肌纤维断裂不规则（图1B，箭头标注），而对照组心肌细胞饱满，肌纤维排列整齐（图1A），两组masson染色无明显差异（图1D、1C）。在电镜下，酒精组出现明显可以看到部分肌丝断裂，肌丝间可见润盘缝隙连接区断裂，致密斑消失，脂滴生成（图1F，箭头标注）；而对照组细胞核内染色质有轻度凝集现象，肌细胞各带结构明显，细胞器丰富（图1E）。图1

图1 两组小鼠心肌组织目镜病理和电镜结果

膜片钳实验结果：酒精组小鼠心肌细胞（n=9）APD90较对照组（n=13）明显延长[（37.62±3.53）ms vs（25.77±3.41）ms]，差异有统计学意义（P＜0.05）。图2

离子通道电流及其动力学测量发现，酒精组小鼠的钙通道电流密度绝对值较对照组有所减少[（-7.49±0.56）pA/pF

vs （-10.31±0.60）pA/pF，P＜0.05）]（图3），但酒精组失活动力学检测下半失活电压向负极方向移动，提示较对照组明显失活延迟[（-31.78±1.44）mV vs （-39.55 ± 1.26）mV，P＜0.05]，而激活动力学检测下两组无明显差异。表3

图2 两组小鼠心肌细胞动作电位复极至90%所需时间比较（

图3 两组小鼠心肌细胞L型钙电流电流电压曲线的比较

表3 两组小鼠心肌细胞钙电流动力学指标比较

表3 两组小鼠心肌细胞钙电流动力学指标比较

注：与对照组比较*P＜0.05； V1/2：半失活电位 K：斜率

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实验发现，钠电流与动作电位的诱发及心电传导有关。酒精组小鼠心肌细胞（n=17）和对照组（n=13）的钠电流密度分别为[（36.00±2.41）pA/ pF vs（36.66±1.63）pA/pF] ，无明显统计学差异（P＞0.05，图4），激活和失活动力学中斜率K酒精组均小于对照组，有微小差异，差异有统计学意义（P＜0.05，表4）。

图4 两组小鼠心肌细胞钠电流电流电压曲线的比较

表4 两组小鼠心肌细胞钠电流动力学指标比较

表4 两组小鼠心肌细胞钠电流动力学指标比较

注：与对照组比较*P＜0.05。余注见表3

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瞬时外向钾电流是小鼠心室肌细胞复极的主要外向电流。酒精组小鼠心室肌细胞（n=9）钾电流密度与对照组（n=9）无明显差异[（44.45±6.45）pA/ pF vs（48.93±8.74）pA/pF，P＞0.05]，且两组小鼠心肌细胞瞬时外向钾通道动力学也无明显差异（P＞0.05）。图5、表5

图5 两组小鼠心肌细胞瞬时外向钾电流电流电压曲线的比较

表5 两组小鼠心肌细胞瞬时外向钾通道动力学比较

表5 两组小鼠心肌细胞瞬时外向钾通道动力学比较

注：V1/2和K注释见表3

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3 讨论

饮酒是常见的猝死原因[7]，长期大量饮酒可使心脏扩大，心肌纤维结构紊乱，心肌收缩功能减退，左心室射血分数降低[8]，且可增加心源性猝死风险[9]。本研究中酒精组小鼠通过5个月的酒精饲养和灌胃，出现LVEF和LVFS降低等心功能下降等情况；病理检查发现酒精组小鼠心肌细胞肌纤维断裂不规则，电镜下肌丝断裂，润盘缝隙连接区断裂，致密斑消失，脂滴生成；同时酒精组小鼠心电图QTc显著延长；这些特征与相关报道相符[6,10,11]。在全细胞膜片钳实验中，酒精组小鼠APD90延长，钙通道失活延迟，钙通道窗口电流增大。虽然酒精组小鼠的钙电流密度减小，但是其失活动力学显著延迟，钙通道窗口电流增大，提示钙通道功能部分上调。此外，钙通道功能的上调是8型长QT间期综合征患者QTc延长的原因之一，Boczek等[12]的研究发现突变的钙通道虽然电流减小，但是开放提前，功能上调，最终的结果是窗口电流增大，这就表明钙通道在激活和失活的交替过程中，有更多的钙离子进入细胞，导致复极时所需钾离子增多。本研究发现钙通道电压依赖性失活延迟而电压依赖性激活变化不明显，综合起来可导致窗口电流增大，这与之前的研究结果有类似之处，同时我们还发现瞬时外向钾电流密度无明显差异；综合来看，以上因素可能是动作电位时程延长的主要原因之一。而且钙通道窗口电流增大还可引起早期后除极，这也是导致心律失常发生的重要机制之一[13]。有研究[14]发现，在急性酒精浸润情况下，细胞动作电位缩短，钠电流、钾电流、钙电流都有一定程度减小，但这反映的是酒精的急性作用，并不能说明在长期酒精作用下患者心脏电生理是否发生改变。本研究的结果提示钠电流可能并不是导致酒精性心肌病心电活动异常的主要原因。我们发现长期饮酒使钙通道的失活延迟，开放时间相对延长，导致钙通道窗口电流增大，从而使动作电位时程延长，最终促使小鼠QTc延长，而QTc延长是引起心室复极异常的重要原因，后者为猝死的心电基质[15]。这为酒精性心肌病患者猝死发生率升高提供了新的电生理学理论依据。

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The Electrophysiological Mechanism of QT Prolongation in Experimental Mice With Alcoholic Cardiomyopathy

JIANG Yu, HAN Zhong-lin, CAO Ke-jiang, WANG Dao-wu.
Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing (210029), Jiangsu, China

Objective: To investigate the electrophysiological mechanism of QT prolongation in experimental mice with alcoholic cardiomyopathy (ACM).

Alcoholic cardiomyopathy; QT interval; Patch clamp; Action potential duration, L-type calcium current

2014-12-19）

（编辑：朱柳媛）

国家自然科学基金面上项目（81170159）；江苏省六大人才高峰资助项目（2012-WS-018）

210029 江苏省南京市，南京医科大学第一附属医院 心血管内科

江宇 硕士研究生 主要从事心脏起搏与电生理相关研究 Email: 328450715@qq.com 通讯作者：汪道武 Email: david37212@hotmail.com

R54

A

1000-3614（2015）04-0374-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.04.018