西洛他唑对大鼠右心室肌细胞离子通道的影响

何蓉，李广平，李健，程立君

西洛他唑对大鼠右心室肌细胞离子通道的影响

何蓉，李广平，李健，程立君

目的：观察西洛他唑对大鼠右心室肌细胞离子通道的影响，探讨西洛他唑预防Brugada 综合征室性心律失常发生的离子通道机制。

方法：本研究包括两部分实验：①灌流实验，分为1、2、5、50 μmol/L西洛他唑组，每组记录的细胞数分别为9、5、3、7个。分别观察每组给药前后瞬间外向钾电流（Ito）电流密度的变化，并观察四组间用药前后Ito电流密度变化的差异；②口服药物实验，分为空白1组、实验1组、空白2组、实验2组，每组选用的大鼠数分别为7、5、8、6只，分别观察实验组与空白组Ito、L-型钙电流（ICa,L）电流密度的差异。

结果：灌流实验结果：①在1、2、5、50 μmol/L西洛他唑各组中，细胞灌流药物后Ito电流密度均降低，在自指令电压+60 mV时，各组用药前后的Ito电流密度差异有统计学意义（P均＜0.05）。②在各指令电压下时，不同浓度西洛他唑灌流液灌流细胞后Ito电流密度减少率，四组间差异均无统计学意义（P均＞0.05）。口服药物实验结果：①在自指令电压-50 mV到最大+60 mV，实验1组Ito电流密度较空白1组无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）；②在自指令电压为+10 mV，空白2组ICa,L电流密度较实验2组略高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

结论：1、2、5、50 μmol/L西洛他唑灌流液直接作用于大鼠右心室肌细胞，均能明显的抑制Ito，但西洛他唑1～50 μmol/L范围内对Ito的抑制程度没有差异。西洛他唑可能具有抑制Brugada 综合征心律失常发生的作用。

西洛他唑；右心室肌细胞；瞬间外向钾电流；L-型钙电流

Methods: Our research was composed of 2 groups:①Perfusion group, the cells were treated in 4 sub-groups by cilostazole at 1, 2, 5, 50 μmol/L respectively, and there were 9, 5, 3, 7 cells were recorded at each sub-group to observe the differences of current density Ⅰtoat before and after treatment.②Oral group, which included 4 sub-groups: Control 1 with 7 rats, Experiment 1 with 5 rats, and Control 2 with 8 rats, Experiment 2 with 6 rats respectively. The differences of current density Ⅰtoand ⅠCa,Lwere studied between each Control and Experiment sub-groups.

Results: Ⅰn Perfusion group,①with cilostazole 1, 2, 5, 50 μmol/L treatment, the current density Ⅰto decreased in all subgroups, when the self-command voltage at +60mV, the Ⅰto was significantly different in each sub-group at before and after treatment, all P＜0.05. ②When each command voltage decreasing, the reduction rates of Ⅰto were similar among 4 sub-groups, all P＞0.05. Ⅰn Oral group,①When the self-command voltage from -50mV reached the maximum of +60mV, the Ⅰtowas similar between Control 1 and Experiment 1 sub-groups, P＞0.05.②When the self-command voltage at +10mV, the current density ofⅠCa,Lwas slightly higher in Control 2 sub-group than that in Experiment 2 sub-group, P＞0.05.

Conclusion: Direct perfusion of cilostazole in right ventricular cells may inhibit Ⅰtoin experimental rats, such effect was similar with cilostazole treatment at (1-50) μmol/L. Cilostazole might prevent the ventricular arrhythmia in Brugada syndrome in experimental rats.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:54.)

Brugada综合征是一种心电活动紊乱的遗传性疾病，常以晕厥甚至猝死为首发症状，且发作无前兆。Brugada 综合征在亚裔人群非器质性心脏病患者的猝死病因中所占比率约30%[1]。多数学者认为[2,3]，由动作电位1期内外向电流失衡介导的复极假说与Brugada 综合征恶性室性心律失常发生密切相关。其中，瞬间外向钾电流（Ito）、L-型钙电流（ICa,L）是形成2相折返的主要离子通道。目前，植入型心律转复除颤器（ICD）是公认的能预防Brugada 综合征患者发生室性心动过速、心室颤动甚至猝死的有效手段[4]，但它存在除颤阈值升高、误放电、价格昂贵等缺陷。所以，药物治疗仍成为研究方向，尤其是具有心脏高选择性并能阻断Ito和（或）增加ICa,L的药物。关于西洛他唑通过影响离子通道来预防Brugada 综合征快速室性心律失常发生的研究结果目前存在争议。本研究应用膜片钳全细胞记录技术，研究不同浓度的西洛他唑对大鼠右心室肌细胞Ito及ICa,L的影响，探讨其预防Brugada 综合征室性心律失常发生的离子通道机制。

1 资料与方法

对象及分组：2012-03至2013-01分批次自北京医科大学动物中心选择健康Spraque-Dawley雄性大鼠共106只，体重250～400 g。本研究包括两部分实验：①灌流实验，分为1、2、5、50 μmol/L西洛他唑组，每组记录的细胞数分别为9、5、3、7个，分别观察每组给药前后Ito电流密度的变化，并观察四组间用药前后Ito电流密度变化的差异。②口服药物实验，分为空白1组、实验1组、空白2组、实验2组，每组选用的大鼠数分别为7、5、8、6只，根据动物与人体间药物等效剂量换算公式[5]给予大鼠西洛他唑剂量为10 mg/（kg·d），共喂养4周，分别观察实验组与空白组Ito、ICa,L电流密度的差异。

溶液的配制（各成分浓度mmol/L）：①生理台式液：NaCl 136；KCl 5.4；MgCl20.8；CaCl21.8；NaH2PO40.33；HEPES 10；葡萄糖10。（通纯氧后用NaOH滴定pH至7.38～7.4）；②无钙台式液：台氏液中去除CaCl2即可；③KB液：KCl 20；KH2PO410；牛磺酸10；EGTA 10；葡萄糖10；L-谷氨酸70；BSA 0.5%即 5 mg/ml（用KOH滴定pH至7.38～7.4）；④酶解液：于无钙台氏液中加胶原酶II 0.033%；牛血清白蛋白（BSA）0.2%及CaCl250 μM配成；⑤ Ito电极内液（mmol/L）：KCl 20，K-Aspartate 110，MgCl20.5，HEPES 10，EGTA 10，Mg2ATP 5，Na3GTP 0.1，Na2phosphocreatine·4H2O5。（以KOH调节pH至7.30）；Ito细胞外液（mmol/L）：KCl 5， MgCl25，葡甲胺（NMDG）140，HEPES 10，CaCl21.8，CdCl20.2，葡萄糖 10。（以HCl调节pH至7.40）；⑥ICa,L电极内液：CsC l20；Mg2ATP 5；TEA-C l20；Na3GTP 0.1；Asparticacid80 Na2phosphocreatine·4H2O 5；CsOH·H2O 80；MgCl2·6H2O 1；HEPES 10； EGTA 10 （以CsOH 将pH滴定至7.25）；ICa,L电极外液：为生理台式液，具体配方见上述。⑦西洛他唑灌流液：西洛他唑溶于二甲基亚砜（DMSO）配制成5 mmol/L母液，使用时经DMSO稀释加入灌流池后按实验需要DMSO分别达到1、2、5、50 μmol/L，DMSO在灌流池中浓度不超过1%，该溶剂对细胞的影响可忽略。

单个大鼠右心室肌细胞分离规程：10%水合氯醛300 mg/kg麻醉大鼠后开胸迅速剪下心脏置于4℃无钙台式液中，分离主动脉，清洗并挤出心腔内血液后迅速套扎主动脉于Langendorff灌流管上，排气后用无钙台式液以80 cmH2O（1cmH2O=0.098 kPa）压力持续逆行灌流心肌5～6 min后，换用含0.033%胶原酶Ⅱ（Worthington）的无钙台式液以60cmH2O压力灌流13～15 min（两步灌流所用溶液恒温37℃，持续充以100%O2），之后剪取右心室心肌组织，置于含37℃ KB液约10 ml的小烧杯中剪碎，然后转入恒温瓶中用吸管吹打3～5 min后，以120目的尼龙纱网过滤细胞悬液，将滤出液用KB液稀释2倍，分别移入2个15 ml玻璃试管内以500～700 r/min离心2 min弃去上清夜，将附着于管底的细胞沉渣以KB液稀释至40 ml±置于50 ml小烧杯中，在室温（22℃～28℃）下至少静置1 h后用于实验。高质量的单细胞标本可供8～12 h的膜片钳实验。

全细胞膜片钳技术记录：在显微镜灌流池中的心室肌单细胞标本中，选择贴壁牢固、横纹清晰、体积大、立体感强的细胞进行记录。将充有电极内液的玻璃微电极置于膜片钳放大器前级探讨夹持器上，电极尖端置于灌流池中细胞标本的细胞外液中，脉冲方波显示在计算机示波器的封接测试窗口，本研究采用的是2.0～3.5 MΩ电极电阻。通过电压补偿将电压基线调至零位，操作为操纵器使电极尖端碰触到细胞膜，此时测试方波幅度降低，电阻升高，进一步使电极尖端压迫细胞膜，当测试电阻为电极电阻2倍左右时，封接电极尖端与细胞膜，当电阻达1GΩ或以上时，负压吸引或采用放大器的电击功能击打电压脉冲，将封接吸入到电极尖端的细胞膜吸破或打破，即“破膜”；此时电极内液与细胞内液相沟通，全细胞记录状态则形成，示波器上显示跨细胞膜瞬间电容和电流，通过调节放大器上的全细胞电容补偿与串联电阻补偿可消除电容电流及串流电阻引起的误差。上述过程在电压钳模式下进行，故可直接启动应用软件中pCLAMP中相应刺激程序，观察记录细胞膜Ito或ICa,L。为减少细胞间误差。电流密度为电流峰值（单位pA）与电容（单位pF）比值，即：电流密度=pA/pF，同时绘制电流-电压曲线（I-V曲线）。

统计学处理：采用SPSS17.0统计软件。实验数据用均数±标准差表示，两组间比较用独立样本t检验，自身对照采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05认为差异有统计学意义（注：外向电流记为正值，内向电流记为负值）。

2 结果

2.1 不同浓度西洛他唑灌流液对心室肌细胞Ito电流密度的影响

Ito电流呈电压依赖性变化，随去极化电压的升高而递增，在+60 mV时达到电流高峰，呈外向整流特性。1、2、5、50 μmol/L西洛他唑灌流均使4组的I-V曲线明显下移。在自指令电压+60 mV时，1、2、5、50 μmol/L西洛他唑组用药前后的Ito电流密度分别为：（20.82±7.42） pA/pF vs（7.48±2.56）pA/pF；（18.64±7.89） pA/pF vs （7.63±1.78） pA/pF；（18.87±5.05） pA/pF vs（7.19±1.79）；（21.45±2.54）pA/pF vs（6.9±2.31） pA/pF，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。图1～4

图1 1 μ mol/L西洛他唑组用药前后Ito平均电流密度I-V曲线（n=9）

图2 2μ mol/L西洛他唑组用药前后Ito平均电流密度I-V曲线（n=5）

2.2 不同浓度西洛他唑灌流液灌流细胞后4组Ito电流密度减少率比较

在各指令电压下时，不同浓度西洛他唑灌流液组间Ito电流密度减少率，差异均无统计学意义（P＞0.05）。表1

表1 不同浓度西洛他唑灌流液灌流细胞后4组Ito电流密度减少率比较

表1 不同浓度西洛他唑灌流液灌流细胞后4组Ito电流密度减少率比较

注：缩略语注见图1

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2.3 西洛他唑口服制剂对大鼠右心室肌细胞Ito的影响

在自指令电压-50 mV到最大+60 mV，实验1组Ito电流密度较空白1组差异均无统计学意义（P＞0.05）。在+60 mV时，实验1组Ito电流密度（20.23±5.64）pA/pF，空白1组（21.74±8.56）pA/ pF（P＞0.05）。图5

图5 实验1组和空白1组的Ito平均电流密度的I-V曲线

2.4 西洛他唑口服制剂对大鼠右心室肌细胞ICa,L的影响

在自指令电压为+10 mV时，实验2组ICa,L电流密度（-5.17±1.61）pA/pF，空白2组（-6.24±2.65）pA/pF，两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

Ito具有快速激活及失活的特性，其在多数哺乳动物的心肌细胞上均有表达，如：人类、犬、大鼠等。有研究表明，人类心肌与大鼠右心室肌Ito的生理和药理特性相似[6,7]。右心室肌心外膜较右心室内膜及左心室肌含有更多的Ito[8,9]。Di Diego等[10]提示雄性犬心肌细胞上Ito分布明显多于雌性犬。因此，本实验采用雄性SD大鼠作为研究对象，并从大鼠右心室肌取材。

西洛他唑是一种磷酸二酯酶（PDE-Ⅲ）的抑制剂，通常作为一种抗血小板聚集药物[11]，临床上常用于慢性动脉闭塞。它还具有多重心血管效应，如扩张血管、调节血脂、 改善血管内皮功能及治疗缓慢型心律失常等。Tsuchiya等[12]报道，一名67岁的男性Brugada综合征患者反复发作心心室颤动动，给予西洛他唑200 mg/d口服制剂，心室颤动完全得到控制；但是，当暂时停用药物后患者的心室颤动再次发作，重新恢复治疗时，其室性恶性心律失常得以控制。Kanlop等[13]发现，静脉给猪用西洛他唑6 mg/kg，可以增加心室颤动阈值及提高除颤效率，从而减少心室颤动的发生。同样的结论近些年来在我国也有报道，肖国胜等[14]专家通过动物实验证实了西洛他唑明显抑制大鼠右心室肌Ito，且呈浓度依赖性，随着药物浓度的增加，对Ito的抑制程度加深，从而达到治疗室性心律失常的作用。另有研究成功制备了犬Brugada模型，同时采用10 μmol/L西洛他唑灌流液心肌，使犬心室肌跨室壁复极离散度和外膜区域间离散度较对照组明显下降，且未再记录到基础刺激和2相折返诱发下的室性恶性心律失常，结论为西洛他唑能有效的预防Brugada模型犬室性心律失常。但是，也有部分病例报道得出不同的结

果。Abud等[15]报道一个病例，30岁男性Brugada综合征患者进行了ICD治疗以预防心脏事件的发生，同时服用西洛他唑200 mg/d，时间长达1年以上，但从患者ICD事件记录器上仍发现患者发作过数次心室颤动。该报道认为西洛他唑并不能预防Brugada综合征患者心室颤动的发生。同样的结论从另一个病例中得到证实：92岁老年女性不存在心肌收缩功能的异常，患者在服用西洛他唑后发生了室性心动过速，停用药物后室性心动过速消失[16]。

灌流实验结果发现，各组浓度西洛他唑灌流液均能明显的抑制Ito，其机制需要进一步研究，可能是：①西洛他唑直接影响Ito的基本特性，如：抑制Ito的激活、加强它的失活、阻塞Ito孔道等方式；②通过抑制PDE-Ⅲ活性，增加细胞内环腺苷酸（cAMP），通过调节第二信改变蛋白激酶A使一系列功能蛋白的磷酸化发生改变，从而间接影响Ito；另外，本研究发现不同浓度的西洛他唑对Ito的抑制程度差异并没有统计学意义，即西洛他唑在1～50 μmol/L范围内对Ito的抑制程度与药物浓度无明显关系，此结果与肖国胜等[14]的研究结果不一致。可能是因为：较低浓度的西洛他唑与通道的结合已呈“饱和”状态即达到最大的结合率，所以即使再增加药物浓度也不会再增加对Ito的抑制程度。本研究未选择更小浓度的西路他唑灌流液即1 μmol/L以下来观察其对Ito的影响，这是本研究需要进一步研究的方向，以更加明确的判断不同浓度西洛他唑灌流液与Ito的相关性。

口服西洛他唑实验结果发现，实验1组的Ito电流密度与空白1组差异无统计学意义；实验2组的ICa,L电流密度较空白2组略降低，但差异无统计学意义；此结果不排除与喂养周期短或口服给药方式不能达到对离子通道的持续作用等有关，仍需要大量研究进一步论证。

总之，本研究表明，西洛他唑灌流液直接作用于心室肌细胞时能显著抑制Ito；本实验为Brugada综合征的预防和治疗提供一定的实验依据。

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Effect of Cilostazol on the Ion Channel of Right Ventricular Cells in Experimental Rats

HE Rong, LⅠ Guang-ping, LⅠ Jian, CHENG Li-jun.
Department of Cardiology, The Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin (300211), China

Objective: To observe the effect of cilostazol on the ion channel of right ventricular cells in experimental rats, and to explore the ion channel mechanism of ciolstazol for preventing the ventricular arrhythmia in Brugada syndrome.

Cilostazole; Right ventricular cells; Transient outward potassium current; L-type calcium current

2014-06-23）

（编辑：王宝茹）

300211 天津市，天津医科大学第二医院 心脏科 天津市心血管病离子与分子机能重点实验室 天津心脏病学研究所

何蓉 硕士研究生 主要从事心律失常的诊断和治疗 Email:herong1024@163.com 通讯作者：李广平 Email:tjcardiol@126.com

R54

A

1000-3614（2015）01-0054-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.01.015