猫泛白细胞减少症病毒VP2基因快速检测方法的建立与应用

邱 杰，温肖会，翟少伦，吕殿红，宁章勇，魏文康

（1.华南农业大学兽医学院，广州 510642；2.广东省农业科学院动物卫生研究所，广州 510640）

·研究论文·

猫泛白细胞减少症病毒VP2基因快速检测方法的建立与应用

邱 杰1,2，温肖会2，翟少伦2，吕殿红2，宁章勇1，魏文康2

（1.华南农业大学兽医学院，广州 510642；2.广东省农业科学院动物卫生研究所，广州 510640）

为了调查猫泛白细胞减少症病毒（Feline panleukopenia virus, FPV）在猫群中的流行情况，根据GenBank已登录的FPV VP2基因序列设计PCR引物，建立了FPV PCR快速检测方法，并对3004份猫样品进行了检测。结果显示，该方法扩增的VP2基因片段为468 bp左右，检出的最小基因组DNA浓度为6.19×10-8μg/μL，检出DNA浓度低于1 fg/μL，从3004份样品中检测出13份猫泛白细胞减少症病毒核酸阳性样品。本研究针对FPV VP2基因建立的PCR快速检测方法可作为FPV临床早期诊断及快速筛查手段。

猫泛白细胞减少症病毒；VP2基因；PCR

猫泛白细胞减少症（feline panleukopenia，FP）也称猫瘟热、猫细小病毒病，是由猫泛白细胞减少症病毒（Feline panleukopenia virus，FPV）引起的一种高度接触性急性传染病。该病在自然条件下可感染猫科、浣熊科和鼬科等家猫、野猫及野生动物包括动物园国家保护动物（如虎、狮、豹、浣熊等），感染比较普遍[1]；传播性极强，感染动物可通过粪便、呕吐物、鼻涕、唾液、尿液排出病毒从而污染食具、笼子、垫物和周围环境，妊娠母猫也可垂直传播给胎儿，跳蚤和吸血昆虫可成为传播媒介；致病性极强，妊娠母猫胎儿畸形胎甚至流产，死亡率高且无任何前驱症状[2]。目前该病的诊断方法是根据临床表现做出初步诊断，借助胶体金试纸检测、病毒分离、血清学试验等确诊，这些检测方法耗时、费力、准确性不够，难以做大量筛查以满足防控需求[3-5]。近几年城市里动物园猫科动物增多，参观人数较多，同时家庭宠物猫的养殖量急剧增多而且交流频繁，疫病监测和防控工作受到高度关注，建立适用于宠物、野生动物FPV的早期诊断及大量快速筛查方法迫在眉睫。

FPV为细小病毒科细小病毒属成员，基因组为单股DNA，长约5200 nt，编码2种结构蛋白（VP1、VP2），其中VP2 为主要结构蛋白，是FPV衣壳的主要成分，暴露在衣壳蛋白表面，为FPV 的主要免疫保护性抗原蛋白[6,7]。因此，针对FPV VP2基因建立快速、敏感的PCR检测方法，可为FPV临床早期诊断和快速筛查奠定坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗与病毒 猫四联活疫苗（FP、猫衣原体、猫病毒性鼻气管炎、猫传染性鼻-结膜炎）来自美国辉瑞制药有限公司，批号：A307101A；犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）、小鹅瘟病毒（Goose parvovirus，GPV）、猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、FPV由广东省农业科学院动物卫生研究所动物疫病诊断中心保存。

1.1.2 待测样品 2013年5月至2014年4月在广州市5家动物医院收治的门诊中共采集3004份样品，包括泄殖腔棉试子、粪便、全血、病死猫的肠道等样品，由广东省农业科学院动物卫生研究所动物疫病诊断中心保存。

1.1.3 主要试剂和工具酶 Taq DNA 聚合酶、dNTP、DL 2000 Marker 等均购自大连宝生物工程有限公司；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒、2×Taq PCR MasterMix购自北京天根生化科技有限公司。

1.1.4 主要仪器设备 S1000 梯度PCR仪购自美国伯乐公司；1600凝胶成像系统、EPS-300电泳仪购自上海天能科技有限公司；DU730核酸分析仪购自美国贝克曼公司；AC204电子天平购自瑞士梅特勒-托力多仪器有限公司；DK-8D三孔电热恒温水槽购自上海齐欣科学仪器有限公司；移液器购自德国Eppendorf公司；PIC017离心机购自德国贺利氏公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据 GenBank 已公布的FPV VP2基因序列（登录号：DQ474237.1、FJ405225.1、EU697387.1、AB054227.1、AB054225.1），用 Primer Premier 5.0软件设计一对FPV VP2基因特异性引物，用于FPV VP2基因扩增。预期扩增产物片段长度约为468 bp。FPVF∶5'-TGGTTCTGGGGGTGTGGG-3'；FPVR∶5'-GCTGCTGGAGTAAATGGC-3'。以上引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2.2 样品前处理 泄殖腔棉试子、粪便等样品：4722×g离心2 min，取上清液备用；全血样品：待血凝后经4722×g离心2 min，取血清备用；肠道样品：称取0.05 g于研磨器中研磨，加入1.5 mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5 mL灭菌离心管中，4722×g离心2 min，取上清液备用。

1.2.3 模板制备 经前处理的样品按照天根生化科技有限公司病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒操作说明书，提取病毒基因组，-20℃保存备用。

1.2.4 FPV VP2基因PCR扩增体系 在 PCR 反应管中分别加入灭菌ddH2O 7 μL、2×Taq PCR MasterMix 10 μL、上下游引物（20 pmol/μL）各0.5 μL、模板 2 μL，共20 μL PCR扩增体系。

1.2.5 FPV VP2基因PCR扩增反应条件的优化 运用正交法梯度性地改变变性温度和时间，退火温度和时间、延伸时间以及循环数等条件，确定上下游引物的最佳循环扩增条件。

1.2.6 FPV VP2基因PCR扩增特异性试验 以猫四联活疫苗、犬细小病毒、小鹅瘟病毒、猪细小病毒、FPV提取的基因组进行PCR，灭菌ddH2O为阴性对照，验证该PCR方法的特异性。

1.2.7 FPV VP2基因扩增序列序列分析 取猫四联活疫苗基因组 PCR 扩增产物 50 μL 送上海生工生物工程股份有限公司进行测序，并将测序结果提交NCBI Blast进行比对。

1.2.8 FPV VP2基因PCR扩增敏感性试验 将猫四联活疫苗提取的基因组用核酸分析仪确定其浓度，然后将其按10倍递减稀释至 10-9，用引物对其进行 PCR扩增，验证该PCR方法的敏感性。

1.2.9 FPV VP2基因PCR扩增重复性试验 将猫四联活疫苗在相同条件下，重复进行 8次基因组DNA提取和 PCR检测，以验证该PCR方法的重复性。

1.2.10 临床样品检测 运用猫泛白细胞减少症金标检测试纸条和已建立的FPV VP2基因PCR检测方法对3004份猫样品分别进行了检测。

2 结果

2.1 FPV VP2基因PCR扩增反应条件最佳循环扩增条件为：95℃预变性 5 min；95℃ 变性30 s，50℃延伸30 s，72℃延伸30 s，共进行30个循环；最后 72℃延伸 7 min，4℃保存。

2.2 FPV VP2基因PCR扩增特异性试验经 1.2% 琼脂糖凝胶电泳显示，FPV和猫四联活疫苗基因组 PCR产物在468 bp左右出现了一条特异性目的片段，与预期大小相符，犬细小病毒、小鹅瘟病毒、猪细小病毒等细小病毒科基因组、灭菌ddH2O阴性对照没有条带出现（图1）。

图1 FPV VP2基因PCR检测特异性试验Fig.1 Specifi city test of PCR for detecting FPV

2.3 猫四联活疫苗基因组扩增片段序列分析将扩增到的猫四联活疫苗基因组片段测序，序列测定结果提交NCBI Blast 进行检索比对，鉴定为FPV VP2基因片段，结果表明，本研究设计的FPV VP2基因引物能准确扩增到FPV基因。

2.4 FPV-VP2基因PCR扩增敏感性试验用核酸测定仪测定猫四联活疫苗基因组的浓度为0.619 μg/ μL，OD260与OD280的比值为 1.81，按 10倍递减稀释至 10-9，PCR扩增体系为 20 μL，模板为 2 μL。能检出的最小基因组DNA浓度为6.19×10-8μg/μL（图2）。

图2 FPV VP2基因PCR检测敏感性试验Fig.2 Sensitivity test of PCR for detection of FPV

2.5 FPV-VP2基因PCR扩增重复性试验经 1.2% 琼脂糖凝胶电泳显示，8次提取的猫四联活疫苗基因组DNA的PCR扩增结果均出现了清晰明亮的目的条带（图3）。

2.6 临床样品检测FPV金标检测试纸条从5家动物医院共检测出10份疑似FPV阳性样品，本研究建立的FPV-PCR检测方法不但从以上10份疑似猫泛白细胞减少症阳性样品中检测出FPV核酸阳性样品，而且从2994份FPV金标检测试纸条检测阴性的样品中检测出3份FPV核酸阳性样品（表1），结果表明，建立的FPV-PCR检测方法不但准确而且更为灵敏。

图3 FPV VP2基因PCR扩展重复性试验Fig.3 Repeatability test of PCR for FPV VP2 gene

表1 3004份猫样品金标试纸条和PCR检测结果Table1 The detection result of PCR and Colloidal gold immunostrip for 3004 samples

3 讨论

FPV与CPV、水貂肠炎病毒（Mink entertis virus，MEV）三者血清抗体彼此间有交叉反应，病毒基因组之间同源性比较高。CPV可在犬或猫细胞复制，而猫细小病毒只能在猫细胞中复制[2]。FPV在自然条件下能够感染猫科和鼬科多种动物，CPV遗传特性、基因组特点与FPV相似，起初CPV2型只感染犬跟犬属动物，并不感染猫。随着病毒重要氨基酸的不断变异，CPV出现新的变异株，导致病毒的宿主范围扩大，能够引起猫的感染[8,9]。因此，设计的引物必须具有特异性，能准确扩增到FPV基因组。结构蛋白VP2是病毒重要的抗原性蛋白，在诱导机体的免疫反应和病毒感染的过程中占主导地位，病毒的遗传变异也主要体现在该蛋白序列中[10,11]。通过对FPV、CPV、MEV VP2基因进行比对，选取FPV VP2特异性基因序列设计特异性引物。

近年来，宠物饲养量快速增加，北京、上海、广州、重庆和武汉已被称为“中国五大宠物城市”[12]。宠物携带疫病可快速传播，引起很多负面影响[13,14]。随着人员流动，宠物犬猫也会乘坐相应的交通工具流动，增加了宠物疫病如犬瘟热、猫瘟热、狂犬病等潜在传播流行的风险[15]。2013年4月农业部首次颁发了《关于进一步加强犬和猫产地检疫监管工作的通知》，严格要求开展犬、猫产地检疫，在调运犬、猫前应进行相应疫病的实验室检测。然而，目前FPV快速检测没有相应的国家标准和行业标准，国内对猫泛白细胞减少症的检疫方法也很少报道，一般沿用传统分离、血清学等方法，耗时耗力，难以满足进一步加强犬和猫产地检疫监管和进行大量的病原筛查工作的要求。

本研究根据GenBank已登录的FPV VP2基因序列设计PCR扩增引物，成功建立了FPV PCR检测方法，通过与FPV金标检测试纸条进行对比，建立的FPV PCR检测方法不但从10份疑似猫泛白细胞减少症阳性样品中检测出FPV核酸阳性样品，而且从2994份FPV金标检测试纸条检测阴性的样品中检测出3份FPV核酸阳性样品。可见，本研究建立FPV检测方法具有良好的特异性、重复性、敏感性，可以作为FPV流行病学调查的一种方法，满足了政府产地检疫的需求。

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DEVELOPMENT AND APPLICATION OF PCR ASSAY FOR DETECTION OF FELINE PANLEUKOPENIA VIRUS

QIU Jie1, 2, WEN Xiao-hui2, ZHAI Shao-lun2, LV Dian-hong2, NING Zhang-yong1, WEI Wen-kang2

(1.College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2.Institute of Animal Health, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China)

To investigate the prevalence of Feline panleukopenia virus in cats, PCR method was developed using primers designed from the sequence of VP2 gene of Feline panleukopenia virus in GenBank.The amplifi ed VP2 gene fragment was 468 bp in length.The minimal DNA detection concentration was 6.19×10-8μg/μL, which was below 1 fg/μL.This PCR method was used to test 3004 samples.Total 13 samples were confi rmed positive for Feline panleukopenia virus.Therefore, the PCR method developed here is suitable for early diagnosis and epidemiological investigation of Feline panleukopenia virus in pets and wild animals.

Feline panleukopenia virus; VP2 gene; PCR

S852.659.2

文章编号：1674-6422（2015）02-0021-05

2014-12-02

省部产学研合作科技创新平台项目（2012B090600048）；广州市科普项目（2013KP093、2013KP072）；广州市动物疫病诊断行业工程技术中心（穗科信字[2012]224-26号）；广东省农村信息直通车工程（2012A020601010）；广东省科技计划项目（2011B020306001）

邱杰，男，硕士，主要从事小动物诊疗方面的研究

宁章勇，E-mail：ningzhyong@126.com; 魏文康，E-mail：wwk188@tom.com