鸡传染性支气管炎病毒多表位核酸疫苗的构建及其免疫研究

刘 芳，谭 磊，陆 凤，范 瑾，刘开春，王 欣，廖 瑛,仇旭升，孙英杰，宋翠萍，王桂军，丁 铲

（1.安徽农业大学，合肥230036； 2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

·研究论文·

鸡传染性支气管炎病毒多表位核酸疫苗的构建及其免疫研究

刘 芳1, 2，谭 磊2，陆 凤2，范 瑾2，刘开春2，王 欣2，廖 瑛2,仇旭升2，孙英杰2，宋翠萍2，王桂军1，丁 铲2

（1.安徽农业大学，合肥230036； 2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

应用筛选出的鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus, IBV）结构蛋白S1基因的T细胞抗原表位盒、Australia T株和M41株S1基因的B细胞抗原表位，定向克隆入真核表达载体pVAX1，构建成5个真核表达质粒：pVAX-S1T+M、pVAXS1B-M41、pVAX-S1B-T、pVAX-S1T+S1B-M41、pVAX-S1T+S1B-T。将每组提取制备的质粒溶液通过腿部肌肉多点注射免疫7日龄SPF雏鸡，28日龄时加强免疫1次，同时设立PBS组作为对照免疫组。分别在首免前及免疫后7、14、21 d以及二免后10 d翅静脉采血并分离血清，用间接ELISA方法检测抗体效价。二免后10 d用IBV病毒液攻毒测定保护率。ELISA抗体效价结果显示：二免后10 d各免疫组抗体水平达到最高，pVAX-S1B-T、pVAX-S1T+S1B-M41和pVAX-S1T+S1B-T组与PBS组相比差异均具有显著统计学意义 (P＜0.05)，pVAX-S1、pVAX-S1T+M 和pVAX-S1B-T组与PBS组相比差异具有极显著统计学意义 (P＜0.01)。攻毒结果表明，pVAX-S1、pVAX-S1B-T组的保护效率均为75%，高于PBS组（12.5%），表明表位抗原成分能够有效发挥保护效力，与S1全基因疫苗组保护率相当。本研究结果为研制安全有效的新型IBV疫苗提供了新的途径。

传染性支气管炎病毒；抗原表位；核酸疫苗；免疫研究

传染性支气管炎（Infectious bronchitis, IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus, IBV）引起的一种急性、高度接触性传染病，给养禽业造成严重经济损失[1]。IBV存在多个血清型，给疫病的防控带来极大困难。

生产中常采用弱毒疫苗对IB进行预防控制，但存在毒力返强的隐患[2]。灭活疫苗对冠状病毒感染的免疫效果不确实，且其副作用可能造成较严重及较长时间的局部反应[3,4]。DNA疫苗（又称核酸疫苗），是将编码病原体免疫原性蛋白的基因克隆到真核表达元件的序列后面，再导入动物机体内，通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，从而诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答。由于DNA疫苗能模拟病毒自然感染过程中抗原提呈的过程，使表达的抗原能以天然的形式加工提呈给免疫识别系统，从而有效地诱导机体产生广泛的体液免疫和细胞免疫，因而在多种疾病的防治研究中已显示出巨大的应用潜力[5]。

常规DNA疫苗具有安全性好和诱导全方位免疫应答等优点，但它需要以整个基因为目的片段，且通常只能携带一个目的基因，诱导的免疫保护力有限。而表位疫苗则突破了常规DNA疫苗的局限，多表位DNA疫苗[6-9]除了可同时激活细胞和体液免疫之外，还具有诸多优点：内源性表位提呈可避免表位肽的降解；可去除抗原中非相关的和免疫抑制性区域，降低免疫耐受和自身免疫发生的可能性，同时可去除潜在的致病区域，提高疫苗的安全性；可使免疫效应集中在高度保守的特异性表位，防止抗原调变导致免疫逃逸；在单一载体中易于容纳多个不同抗原，更具有广谱性。

本实验室前期应用生物信息学方法预测并验证筛选获得了IBV Australia T株和M41株的结构蛋白S1基因的T细胞抗原表位盒以及B细胞抗原表位盒[10]。本研究基于此T、B细胞表位盒构建了5组表位相关真核表达质粒pVAX-S1T+M、pVAX-S1B-M41、pVAX-S1B-T、pVAX-S1T+S1B-M41、pVAXS1T+S1B-T。免疫动物后，用间接ELISA方法检测体液免疫水平，通过攻毒保护率来评价免疫效果，为研制能有效防止IB流行的新型DNA疫苗提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 毒株、载体IBV经典呼吸型M41株和肾型Australia T株为本实验室保存；感受态细胞购自天根公司；pET-28a(+)、pVAX1表达载体由本实验室保存；pMD19T-simple载体购于宝生物公司；真核表达质粒pVAX-S1由本实验室构建保存。

1.2 实验动物SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物有限公司（9～11日龄SPF鸡胚和SPF雏鸡由本实验室自行孵化饲养）。

1.3 主要试剂T4连接酶为美国Promega公司；各种限制性内切酶购自宝生物公司；质粒提取试剂盒为QIAGEN Plasmid Midi kit；酶标兔抗鸡IgG购自Sigma公司；ELISA板购自Corning公司。

1.4 真核表达质粒的构建pVAX-S1T+M的构建：将合成的IBV S1基因T细胞表位盒（S1T）用Cla I 和Xho I双切回收备用。利用IBV M41株特异性引物扩增M基因连入pMD19T-simple载体，阳性质粒用Cla I和Xho I双切回收，连接Cla I和Xho I双酶切的S1T表位盒。Hind III和Xho I双酶切回收，连接入相同酶切的载体pVAX，构建成pVAXS1T+M。pVAX-S1B-M41、pVAX-S1B-T的构建：分别筛选了IBV病毒M41株、Australia T株的B细胞抗原表位S1B-M41、S1B-T，Hind III和Xho I双酶切回收，连接入相同酶切的载体pVAX，构建成pVAX-S1B-M41、pVAX-S1B-T。pVAXS1T+S1B-M41、pVAX-S1T+S1B-T的构建：S1B-M41、S1B-T用Cla I和Xho I双酶切回收，连接Cla I和Xho I双酶切的S1T表位盒，Hind III和Xho I双酶切回收，连接入相同酶切的载体pVAX，构建成pVAX-S1T+S1B-M41、pVAX-S1T+S1B-T。

1.5 动物免疫保护实验

1.5.1 大量制备免疫用核酸DNA 分别将pVAX-S1、pVAX-S1T+M、pVAX-S1B-M41、pVAXS1B-T、pVAX-S1T+S1B-M41、pVAXS1T+S1B-T的阳性质粒重新转化DH5α感受态细胞，用QIAGEN Plasmid Midi kits 进行质粒中量提取，获得的质粒用紫外核酸蛋白分析仪测定质粒纯度和浓度，-20℃保存备用。

1.5.2 攻毒用毒株ELD50的测定 将IBV Australia T株尿囊液进行10倍梯度稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10稀释度的病毒液尿囊腔接种SPF鸡胚，每个稀释度接种7枚胚，0.1 mL/枚。同样IBV M41株取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9稀释度的病毒液接种SPF鸡胚。连续观察5 d，24 h内死亡的鸡胚弃去。记录鸡胚死亡情况，用Reed-Muench法计算鸡胚半数致死量（median embryo lethal dose，ELD50）。

1.5.3 实验分组及免疫程序 将70只SPF鸡随机分成7组，每组10只（表1）。7日龄首免，首免后3周（28日龄）加强免疫1次。

表1 实验分组及免疫程序Table1 Grouping and immunization program in this study

1.5.4 ELISA检测特异性IBV IgG抗体 首免前及免疫后7、14、21 d以及二免后10 d每组随机抽取3只鸡颈静脉采血并分离血清，用间接ELISA方法检测抗体效价。具体方法：将IBV病毒液用包被液10倍稀释后，加入酶标板中，100 μL/孔，4℃过夜；弃掉液体，PBST洗板3次，300 μL /孔，每次3 min，每孔加入200 μL 10%胎牛血清封闭， 37℃作用2 h；PBST洗板3次，加入提前用PBS稀释20倍的待测血清，100 μL/孔，37℃作用2 h；PBST洗板3次，加入兔抗鸡酶标抗体IgG（PBS按1∶5000稀释），100 μL/孔，37℃作用1 h；PBST洗板3次，加入TMB底物溶液，100 μL/孔，避光室温作用20 min；加入2N H2SO4100 μL/孔终止反应，于波长450nm下测定各孔OD值。

1.5.5 攻毒保护实验 二免后d10攻毒，用IBV Australia T株和M41株病毒液混合后，经滴鼻点眼进行攻毒，106ELD50/只，攻毒后观察各组鸡发病情况，连续观察2周。

攻毒后d4、6、8、10、12、14采集泄殖腔棉拭子，置于无菌PBS中，反复冻融3次，8000×g离心10 min，取上清液提取RNA作为模板，用荧光定量PCR法检测排毒量。构建IBV M41株M基因的质粒pMD19T-M，作为绘制标准曲线的标准品质粒。

2 结果

2.1 真核表达质粒的构建成功构建了pVAXS1T+M、pVAX-S1B-M41、pVAX-S1B-T，pVAX-S1T+S1B-M41和pVAX-S1T+S1B-T 五个重组质粒，用于后续免疫保护实验。

2.2 动物免疫保护实验

2.2.1 特异性IBV血清抗体的ELISA检测 ELISA结果显示各疫苗组在首免后7 d抗体水平有所上升，随着免疫时间的延长其抗体水平逐渐增高，各疫苗组均高于PBS对照组 (P＜0.05)，并在二免后d10达到最高水平，pVAX-S1B-T、pVAX-S1T+S1B-M41和pVAX-S1T+S1B-T组与PBS组相比差异均具有显著统计学意义 (P＜0.05)，pVAX-S1、pVAX-S1T+M 和pVAX-S1B-T组与PBS组相比差异具有极显著统计学意义 (P＜0.01)（图1）。

图1 免疫后各组抗体水平Fig.1 Antibody level of each group after immunization

图2 攻毒后各组保护效力Fig.2 Productive effi cacy of DNA vaccines in each group

2.2.2 攻毒保护实验 各组攻毒后保护率如图2所示。攻毒后d4 PBS组出现流鼻涕、甩头症状，伴有气管啰音，部分鸡开始出现死亡，攻毒后d14死亡率达87.5%。死亡鸡剖检病变主要在呼吸道和肾脏，具体表现为上呼吸道充满黏液，喉头肿胀，气管出现点状出血，肾脏肿大，呈典型的花斑型肾。疫苗免疫组pVAX-S1和pVAX-S1B-T免疫后，有效诱导了鸡体的体液免疫和细胞免疫反应，能提供75%的保护率。

制备的标准品质粒pMD19T-M浓度为11.5 ng/μL，质粒大小为678 bp，换算成拷贝数为3.221×107copies/μL。当标准品在10-2～10-8范围内稀释时，线性关系良好。以Ct值为y轴，对应的标准品拷贝数的对数为x轴，绘制标准曲线（图3）。标准方程为y=-3.5982x+33.688，相关系数R2为0.9993。

图3 荧光定量PCR检测pMD19T-M的标准曲线Fig.3 The standard curve graph of pMD19T-M by real time qPCR assay

荧光定量PCR检测显示攻毒后d4各组均开始出现排毒，以PBS组排毒量最高，pVAX-S1B-T组排毒量最低（图4）。

3 讨论

表位核酸疫苗是在总结核酸疫苗与多肽疫苗优点的基础上发展出来的一种新型疫苗，它通过人工设计的方法用间隔序列将有效的疫苗抗原表位序列串连在一起，构成一个全新疫苗候选基因[11]。它比常规疫苗具有更多优势[12]：仅含免疫相关序列而无多余无用的序列，可诱导更强烈的免疫反应；可表达多个不同的保护性抗原表位，诱导多重免疫保护性反应，进而提高疫苗保护水平；设计的全新复合表位可改变表位在毒性抗原蛋白中的次序，因此新表达的蛋白降低了原蛋白的毒性而保留其免疫原性；可对多表位基因进行修饰，如添加N端信号肽引导序列、通用性细胞表位、免疫刺激基序等，使其获得最佳的免疫效果；比活载体苗、常规DNA疫苗更安全，无基因整合、重组等问题。因此，表位疫苗在未来疫苗研究中有广泛的应用前景。

本研究应用筛选出的IBV的结构蛋白S1基因的T细胞抗原表位盒、Australia T株和M41株的S1基因的B细胞抗原表位，构建了5个真核表达质粒pVAX-S1T+M、pVAX-S1B-M41、pVAX-S1B-T、pVAX-S1T+S1B-M41、pVAXS1T+S1B-T，共同免疫7日龄雏鸡，血清抗体的ELISA检测结果显示各疫苗组的抗体效价水平均高于PBS对照组（P＜0.05），并在二免后d10达到最高水平，pVAX-S1B-T、pVAX-S1T+S1B-M41 和pVAX-S1T+S1B-T组与PBS组相比差异均具有显著统计学意义 (P＜0.05)，pVAX-S1、pVAXS1T+M 和pVAX-S1B-T组与PBS组相比差异具有极显著统计学意义 (P＜0.01)。攻毒保护实验结果显示pVAX-S1、pVAX-S1B-T组均能提供75%免疫保护效力。结果表明本研究成功筛选到一组由Australia T株S1基因的B细胞抗原表位构建的真核表达质粒pVAX-S1B-T，筛选的B细胞抗原表位发挥了重要作用，能有效诱导鸡体的免疫反应，与全基因免疫组pVAX-S1相比能提供更好的保护率。而本研究中构建的T细胞表位和B细胞表位混合组pVAXS1T+S1B-M41和pVAX-S1T+S1B-T虽然IgG抗体效价较高，但是在攻毒保护实验中混合表位组保护率较低，可能是由于多表位成分较为复杂，表位间相互影响造成没有完全发挥效力，下一步研究中将优化混合表位组的表位组合，以期提高细胞免疫和体液免疫水平。

图4 攻毒后各组排毒量Fig.4 Viral shedding in each group after challenge

本研究获得了一组能够与IBV S1全基因提供相同保护率的表位疫苗pVAX-S1B-T，为进一步构建嵌合IBV表位重组病毒提供了重要的表位信息，为研制安全有效的新型IBV疫苗提供了新的途径。

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CONSTRUCTION AND IMMUNOGENICITY OF A MULTI-EPITOPE DNA VACCINE AGAINST INFECTIOUS BRONCHITIS VIRUS IN CHICKENS

LIU Fang1, 2, TAN Lei2, LU Feng2, FAN Jin2, LIU Kai-chun2, WANG Xin2, LIAO Ying2, QIU Xu-sheng2, SUN Ying-jie2, SONG Cui-ping2, WANG Gui-jun1, DING Chan2

(1.Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

Infectious bronchitis virus; epitope ; DNA vaccine ; immunization

: The T cell epitope box of structural protein S1 gene of avian Infectious bronchitis virus (IBV) and B cell epitopes of Australia T strain and M41 strain S1 gene were cloned into the eukaryotic expression vector pVAX1, constructing five groups of eukaryotic expression plasmids: pVAX-S1T+M, pVAX-S1B-M41, pVAX-S1B-T, pVAX-S1T+S1B-M41 and pVAX-S1T+S1B-T.The plasmid solution from each group was administered to 7-days-old chickens via intramuscular route.Three weeks later, chickens were boosted with the same doses of DNA vaccines.Chickens receiving PBS served as controls.Blood samples were taken at 0, 7, 14 and 21 days post the fi rst vaccination and 10 days post the second vaccination.Anti-IBV specifi c antibodies were measured in indirect ELISA.At 10 days post the second vaccination, chickens were challenged with virulent IBV strains.The result showed that antibody titers of chickens immunizedwith pVAX-S1, pVAX-S1T+M and pVAX-S1B-T were signifi cantly higher (P＜0.01) than that of control group.The protection against the challenge was achieved in 75% chickens administered with pVAX-S1 and pVAX-S1B-T.In conclusion, the present study provided a new strategy to enhance the protection of IBV DNA vaccine.

2014-12-08

上海市科技兴农重点攻关项目（沪农科攻字（2013）第3-7号）

刘芳，女，硕士研究生，预防兽医学专业

王桂军, E-mail∶ wangguijun@ahau.edu.cn；丁铲, E-mail∶shoveldeen@shvri.ac.cn

S852.659.6

A

1674-6422（2015）02-0026-06