一株H3N2亚型犬流感病毒的分离与进化分析

王晓丽，毕振威，王永山，潘群兴，欧阳伟，夏兴霞，诸玉梅，董晨红

（江苏省农业科学院兽医研究所 农业部兽用生物制品工程技术重点实验室 国家兽用生物制品工程技术研究中心，南京210014）

·研究论文·

一株H3N2亚型犬流感病毒的分离与进化分析

王晓丽，毕振威，王永山，潘群兴，欧阳伟，夏兴霞，诸玉梅，董晨红

（江苏省农业科学院兽医研究所 农业部兽用生物制品工程技术重点实验室 国家兽用生物制品工程技术研究中心，南京210014）

2012年从南京市某宠物医院采集的20份犬鼻拭子中分离到1株犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV），命名为A/ Canine/Nanjing/11/2012（H3N2）。该病毒分离株的血凝素（hemagglutinin，HA）效价为28，鸡胚半数感染量（median embryo infective dose，EID50）和最小致死量平均死亡时间（mean death time，MDT）分别为10-7.60/0.1 mL和69.6 h/10-4。血凝素（HA）基因、神经氨酸酶（neuraminidase，NA）基因和核蛋白（necleoprotein，NP）基因的系统发育进化树均显示该分离株CIV位于禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）亚群中，并与H3N2亚型CIV辽宁分离株和黑龙江分离株位于同一分支上，具有最近的亲缘关系（HA基因的同源性为99.5%～99.6%，NA基因的同源性为99.0%～99.2%，NP基因的同源性为99.1%～99.3%）。氨基酸序列分析显示，该病毒分离株与其他犬流感病毒分离株的HA、NA和NP氨基酸序列存在个别位点的突变。

犬流感病毒；H3N2亚型；分离；变异；系统发育进化树

流感病毒（Influenza virus，IV）A型属于正粘病毒科、流感病毒属，可感染人、马、猪和禽类等多种宿主[1]。过去一般认为犬不是流感病毒A型的易感动物，但是近年来发现不同亚型的流感病毒可感染犬，引起犬发生咳嗽、喷嚏、流鼻涕和发热等临床症状[2]。2004年，美国佛罗里达发生了由马源流感病毒H3N8亚型引起的犬流感。2007年在韩国流行的犬流感病毒是禽源流感病毒H3N2亚型。另外也有报道称从犬体内检测到H5N1亚型流感病毒[3,4]。在2010年研究人员在中国广东省分离到禽源H3N2亚型的犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV）[5]。Lin等[6]2009～2010年从江苏省分离了6株H3N2亚型CIV，在系统发育树上与韩国的1株猫源H3N2亚型禽流感病毒的亲缘关系最近。2012年，从山东省某发病犬体内检出的CIV则被鉴定为是1株重配的H5N2亚型IV[7]。

近年来，由于犬养殖业和宠物犬行业的发展和兴起，人类与犬的接触日益频繁和密切。鉴于犬类不断发生流感以及犬在人类IV演变中扮演的角色还不清楚，对CIV进行分离和研究具有重要的公共卫生意义。本研究从南京市宠物医院具有呼吸道症状的犬群中分离到1株CIV，并对其血凝素（hemagglutinin，HA）、神经氨酸酶（neuraminidase，NA）和核蛋白（nucleoprotein，NP）基因进行了变异性分析。

1 材料与方法

1.1 病料与鸡胚采集具有咳嗽、发烧、喷嚏、流涕临床症状的犬鼻拭子样本保存于30%甘油生理盐水中，-20℃保存；10日龄SPF鸡胚购自南京天邦生物科技有限公司。

1.2 主要试剂Trizol Reagent购自Invitrogen公司；Reverse Transcriptase XL（AMV）反转录酶、dNTPs、Ex Taq DNA聚合酶、DL5000 DNA Marker、pMD18-T载体、T4 DNA 连接酶均购自宝生物工程（大连）有限公司；胶回收（小量）试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司；E.coli Top10购自天根生化科技有限公司。

1.3 病毒分离将冻存的犬鼻拭子溶液用0.2 μm滤器过滤，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每个拭子接种3枚鸡胚，0.1mL/枚。37℃孵育，弃去24 h内死胚，每8 h观察1次，出现的死胚置4℃保存，120 h后的存活胚置4℃过夜。无菌收集鸡胚尿囊液，盲传3代，测血凝效价，无血凝（hemagglutination, HA）活性者弃之。

1.4 鸡胚终点稀释法纯化对有血凝活性的鸡胚尿囊液做10倍梯度稀释，选取10-6、10-7、10-8、10-9、10-10五个稀释度分别接种5枚10日龄SPF鸡胚尿囊腔，0.1 mL/枚，37℃孵育。分别收集24～120 h死胚和120 h活胚尿囊液，测定每胚的血凝（hemagglutination, HA）活性，选取最高稀释度的含毒尿囊液按相同方法连续稀释传代3次。

1.5 EID50和MDT测定用无菌生理盐水将纯化的含毒尿囊液作10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8、10-9四个稀释度分别接种10日龄鸡胚，上午8点每个稀释度接种5枚鸡胚，0.1 mL/枚。接种后剩余的病毒稀释液4℃保存，下午5点每个稀释度再同法分别接种剩余的5枚鸡胚。接种后每日上午8点、下午5点，各照蛋1次，记录每胚的死亡时间，并测定每胚HA活性。观察7d后，将所有活胚冷却，测定每胚HA活性，按Reed-Muench法计算病毒的鸡胚半数感染量（median embryo infective dose，EID50），上午和下午接种的鸡胚全部死亡的最高稀释度即为最小致死量，计算鸡胚最小致死量平均死亡时间（mean death time, MDT）。

1.6 引物设计与合成根据IV A型各RNA节段的5′端和3′端分别具有13和12个保守核苷酸，采用文献[8]报道的引物序列（表1），对HA、NA和NP基因进行扩增。

1.7 病毒RNA的提取与RT-PCR扩增取纯化的病毒鸡胚尿囊液按Trizol Reagent的使用说明书提取总RNA。用IV反转录通用引物Uni-12进行反转录：8μL RNA、1 μL Uni-12、1 μL dNTPs，65℃作用5 min，冰上放置2 min；再加入0.5 μL MLV、0.5 μL RNA酶inhibitor、4 μL 5×缓冲液、DECP dd H2O 5 μL，42℃作用45 min，70℃作用15 min。以合成的cDNA为模板，用表1中特异性引物分别进行PCR扩增HA、NA和NP基因。PCR反应体系（25 μL）：12.5μL PCR Mix（2×）、9.5 μL ddH2O、上下游引物各1 μL、1 μL cDNA。PCR反应参数：94℃预变性4 min；94℃变性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸7 min，共进行30次循环；最后72℃延伸10 min。

表1 RT-PCR扩增犬流感病毒HA、NA和NP基因的引物序列Table1 Primers for RT-PCR amplifi cation of CIV HA, NA and NP genes

1.8 基因克隆与测序将HA、NA、NP基因PCR扩增产物经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化后与pMD18-T载体连接，连接产物转化E.coli Top10感受态细胞，经蓝白斑筛选和菌液PCR鉴定，选择阳性克隆株送Invitrogen公司测序，将测序结果在GenBank中进行注册。

1.9 HA、NA和NP基因的进化分析用DNAStar软件对该犬流感病毒分离株以及在GenBank中注册的其他代表性流感病毒株的HA、NA和NP基因进行同源性比较，并应用MEGA5.0软件分别构建HA、NA和NP基因的系统进化树，分析其遗传演化关系。

1.10 HA、NA和NP氨基酸序列分析用DNAStar软件将该CIV分离株的HA、NA和NP氨基酸序列与其他流感病毒进行序列比对，构建系统进化树。

2 结果

2.1 病毒的分离20份犬鼻拭子样品经SPF鸡胚盲传、纯化后，获得1株CIV分离株。该分离株病毒的鸡胚尿囊液对1%公鸡红细胞有血凝活性，血凝（HA）效价为28。

2.2 EID50和MDT的测定将病毒尿囊液做10倍梯度稀释接种SPF鸡胚后，经HA活性测定，结果按Reed-Muench方法计算，该分离株病毒的鸡胚半数感染量（EID50）为10-7.60/0.1 mL。当病毒尿囊液的稀释度为10-4时，上、下午接种的鸡胚全部死亡，MDT为69.6 h。

2.3 HA、NA和NP基因的扩增用HA、NA、NP基因的引物分别对该病毒分离株的cDNA产物进行PCR扩增，获得大小约为1800、1500和1600 bp的片段，与预期大小相符（见图1）。将PCR产物分别与克隆载体连接，筛选阳性重组质粒进行测序，获得HA、NA和NP基因序列依次在GenBank登录号为KF322105、KF322106和KF322107。

2.4 HA、NA和NP基因的进化分析将病毒分离株与代表性IV的基因序列进行比对分析，分别构建了HA、NA和NP基因的系统进化树（见图2、3、4）。在3个基因的系统进化树中，所有的流感病毒分离株都分为马源流感病毒、人/猪源流感病毒和禽流感病毒3个亚群。在HA基因系统进化树中，病毒分离株CIV与H3N2亚型CIV辽宁分离株A/Canine/ Liaoning/27/2012（H3N2）和A/Canine/Liaoning/ H6/2012（H3N2）以及H3N2亚型黑龙江分离株A/ Canine/Heilongjiang/L1/2013（H3N2）位于同一分支上，亲缘关系最近（基因序列同源性分别为99.6%、99.6%和99.5%），其次与2010年分离的6株H3N2亚型CIV江苏分离株的同源性较高（基因序列同源性为99.1%～99.2%）。在NA基因系统进化树中，该病毒分离株同样与H3N2亚型CIV辽宁分离株A/Canine/ Liaoning/27/2012（H3N2）和A/Canine/Liaoning/ H6/2012（H3N2）以及H3N2亚型CIV毒黑龙江分离株A/Canine/Heilongjiang/L1/2013（H3N2）在同一分支上，同源性分别为99.2%、99.2%和99.0%，而与2010年分离的H3N2亚型CIV江苏分离株的同源性为98.8%～99.2%。在NP基因系统进化树中，该分离株CIV与H3N2亚型CIV辽宁分离株（A/Canine/ Liaoning/27/2012（H3N2）和A/Canine/Liaoning/ H6/2012（H3N2））以及H3N2亚型CIV黑龙江分离株（A/Canine/Heilongjiang/L1/2013（H3N2））的亲缘关系（基因同源性分别为99.3%、99.2%和99.1%）仍然近于2010年分离的H3N2亚型CIV江苏分离株的亲缘关系（基因同源性为98.7%～98.9）。结果表明该犬流感病毒分离株为H3N2亚型，并在HA基因、NA基因和NP基因系统进化树中均与2012年分离的2株H3N2亚型CIV辽宁分离株和2013年分离的1株H3N2亚型CIV黑龙江分离株的同源关系最近，将该病毒分离株命名为A/Canine/Nanjing/11/2012 （H3N2）。

图1 HA(A)、NA(B)和NP(C)基因的RT-PCR扩增结果Fig.1 RT-PCR amplifi cation for HA(A), NA(B) and NP(C) genes of CIV M: DNA分子量标准；1、2: 分离株RT-PCR扩增产物

2.5 HA、NA和NP氨基酸序列分析本研究分离的H3N2亚型CIV分离株和H3N2亚型CIV江苏分离株、广东分离株、辽宁分离株和黑龙江分离株的HA氨基酸序列与其亲缘关系最近的H3N2亚型禽流感病毒分离株（A/Aquatic bird/Korea/JN-2/2006 （H3N2））相比，共有的突变位点分别是T10A、L79F、D81N、L111I/V、A160T、D172N、G209S和W222L。其中，D81N、A160T和G209S发生在3个不同的抗原位点，T10A和D81N导致了潜在糖基化位点的改变，W222L发生在受体结合位点。但与其他CIV不同的是，A/Canine/Nanjing/11/2012(H3N2)有两处独特的突变位点（E218G和E241D），并不发生在抗原位点区域和受体结合位点，也没有导致糖基化位点的改变。另外，与所有CIV株相同，A/Canine/Nanjing/11/2012（H3N2）的裂解位点是PERQTR↓G。

图2 HA基因核苷酸序列的系统进化树Fig.2 Phylogenetic trees of Infl uenza virus isolates based on the nucleotide sequences of HA gene

图3 NA基因核苷酸序列的系统进化树Fig.3 Phylogenetic trees of Infl uenza virus isolates based on the nucleotide sequences of NA gene

图4 NP基因核苷酸序列的系统进化树Fig.4 Phylogenetic trees of Infl uenza virus isolates based on the nucleotide sequence of NP gene

在NA氨基酸序列比对中发现，A/Canine/ Nanjing/11/2012（H3N2）和H3N2亚型CIV江苏分离株、广东分离株、辽宁分离株和黑龙江分离株与其亲缘关系最近的H3N2亚型禽流感病毒分离株【A/duck/Korea/JS53/2004（H3N2）】的共同突变位点分别是M24L、E54K、P81S、D143N、P156S、I208V、D288N、S372L和R432G。其中，S372L、R432G发生在2个不同的抗原位点。A/Canine/ Nanjing/11/2012（H3N2）与H3N2犬流感病毒辽宁分离株、黑龙江分离株和江苏分离株在NA颈部的末端均有2个氨基酸（E和K）的插入，这与犬流感病毒韩国分离株和广东分离株不同。另外，A/Canine/ Nanjing/11/2012（H3N2）独特的突变位点是N48S、I241V，但这些位点均未发生在抗原位点区域。

在NP氨基酸序列比对中发现，A/Canine/ Nanjing/11/2012（H3N2）和H3N2亚型犬流感病毒江苏分离株、广东分离株、辽宁分离株和黑龙江分离株与同源性最高的H6N5亚型禽源流感病毒分离株【A/mallard/Jiangxi/8346/04（H6N5）】发生的共同突变位点分别是Y52H、N125G、M159L、V353I、T373K、M374I、R389K、L418I、A428T、R452K、N473K[6]。A/Canine/Nanjing/11/2012（H3N2）与其他犬流感病毒相比，有两个位点发生突变，分别是N50S和K236R。而在第456位点，A/Canine/ Nanjing/11/2012（H3N2）与同源关系最近的H3N2亚型犬流感病毒辽宁分离株和黑龙江分离株均是缬氨酸（V），而2009～2010年分离的H3N2亚型犬流感病毒江苏分离株均是甲硫氨酸（M）。

3 讨论

本研究将从南京市某宠物医院采集的20份犬鼻拭子接种SPF鸡胚，经传代和纯化后获得1株犬流感病毒，该病毒分离株对鸡红细胞的血凝HA效价达28，鸡胚半数感染量（EID50）为10-7.60/0.1 mL、最小致死量平均死亡时间MDT为69.6 h/10-4。为进一步鉴定该犬流感病毒分离株，我们分别扩增了HA、NA 和NP基因，并进行了序列同源性分析和系统发育进化分析，结果表明该病毒分离株为H3N2亚型犬流感病毒，命名为A/Canine/Nanjing/11/2012（H3N2）；该犬流感病毒分离株与H3N2亚型犬流感病毒辽宁分离株（A/Canine/Liaoning/27/2012（H3N2）和A/ Canine/Liaoning/H6/2012（H3N2）以及黑龙江分离株A/Canine/Heilongjiang/L1/2013（H3N2）的亲缘关系最近，而不是与之前分离的H3N2亚型犬流感病毒江苏分离株的亲缘关系最近[6]，说明本实验分离的犬流感病毒分离株出现了一定程度的变异。

流感病毒A型有囊膜，膜上含有血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）2种纤突，根据它们抗原特性的不同，将流感病毒分成不同的亚型，而NP蛋白是各个亚型或者亚型内不同毒株之间氨基酸序列相当保守的蛋白，也是A、B、C 3型流感病毒型划分的依据之一。Lin等[6]比较总结了犬流感病毒分离株与禽流感病毒分离株存在的共有氨基酸突变位点，其中HA的共同突变位点是T10A、L79F、D81N、L111I/V、A160T、D172N、G209S和W222L；NA的共同突变位点是M24L、N48S、E54K、P81S、D143N、P156S、I208V、D288N、S372L和R432G；而NP的共同的突变位点是G50S、Y52H、N125G、M159L、V353I、T373K、M374I、R389K、L418I、A428T、R452K和N473K。尽管HA的这些共同突变位点均可在A/Canine/Nanjing/11/2012（H3N2）中找到，但值得注意的是NA的N48S突变并未在该犬流感病毒分离株中发生；而NP的第50位与禽流感病毒的甘氨酸（G）和犬流感病毒的丝氨酸（S）均不同，A/Canine/Nanjing/11/2012（H3N2）分离株为天冬酰胺（N）。本研究获得的犬流感病毒分离株HA、NA及NP蛋白氨基酸位点的变异对病毒特性以及抗原性的影响如何，值得进一步研究。

本研究分离的犬流感病毒分离株是继2009～2010年江苏省南京市分离到6株H3N2亚型CIV之后，又成功分离的1株H3N2亚型CIV。但该犬流感病毒分离株与之前的6株CIV分离株相比出现了不同程度的变异，在亲缘关系上更接近于中国东北地区分离的H3N2亚型CIV分离株。该CIV的分离进一步丰富了CIV的病原学资料，对研究病毒进化机制和方向具有重要意义。

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CHARACTERIZATION OF H3N2 SUBTYPE CANINE INFLUENZA VIRUS ISOLATED IN 2012 IN NANJING, CHINA

WANG Xiao-li, BI Zhen-wei, WANG Yong-shan, PAN Qun-xing, OUYANG Wei XIA Xing-xia, ZHU Yu-mei, DONG Chen-hong

(National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-products, Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and
Technology, Ministry of Agriculture, Institute of Veterinary Medicine, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

In order to investigate the biological characteristics and molecular variation of Canine infl uenza virus (CIV), a total of 20 nasopharyngeal swabs from dogs with severe respiratory syndrome were obtained from animal clinics of Nanjing, Jiangsu province in 2012.A CIV strain designated as A/Canine/Nanjing/11/2012(H3N2) was isolated from these nasopharyngeal swabs using SPF embryonated chicken eggs.The hemagglutination titer, 50% embryo infectious dose (EID50) and mean death time (MDT) of this CIV strain were 28, 10-7.60/0.1 mL and 69.6 h/10-4, respectively.The phylogenetic analysis of HA, NA and NP genes showed that the CIV strain was categorized into H3N2 subtype avian subgroup as it shared high identities (99.5%～99.6% in HA gene, 99.0%～99.2% in NA gene and 99.1%～99.3% in NP gene) with three Chinese CIV strains A/Canine/Liaoning/27/2012(H3N2), A/Canine/Liaoning/H6/2012(H3N2) andA/Canine/Heilongjiang/L1/2013(H3N2).

Canine infl uenza virus; H3N2; isolation; variation; genetic evolution

S852.659.5

A

1674-6422（2015）02-0032-09

2014-09-29

江苏省农业自主创新（CX(12)3062）

王晓丽，女，硕士，副研究员，主要从事新型兽用疫苗与检测试剂盒研究

王晓丽，E-mail：xlw2003@163.com