采用泊洛沙姆为佐剂的O型口蹄疫多肽疫苗对大鼠脾细胞的增值作用

王霄旸，王 米，张可煜，薛飞群

（中国农业科学院上海兽医研究所 中国农业科学院兽药安全评价与兽药残留研究重点开放实验室 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海200241）

·简报·

采用泊洛沙姆为佐剂的O型口蹄疫多肽疫苗对大鼠脾细胞的增值作用

王霄旸，王 米，张可煜，薛飞群

（中国农业科学院上海兽医研究所 中国农业科学院兽药安全评价与兽药残留研究重点开放实验室 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海200241）

为研究泊洛沙姆作为佐剂的O型口蹄疫多肽疫苗对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响，采用四甲基偶氮唑盐法（MTT）检测不同浓度的泊洛沙姆407、 FMDV-O型泊洛沙姆佐剂多肽疫苗（多肽浓度50 μg/mL）、 FMDV O型多肽抗原液（7.06 mg/mL，用PBS稀释至50 μg/mL）及FMDV O型油乳佐剂多肽疫苗（多肽浓度50 μg/mL） 对伴刀豆球蛋白A（Concanavalin A，ConA）处理淋巴细胞的增殖率。结果表明，与空白对照组相比较，泊洛沙姆各浓度对脾细胞均有增殖作用，多肽疫苗在高浓度的时候对细胞有抑制作用，随着作用浓度的降低，又进而转为细胞增殖作用。

细胞增殖; 泊洛沙姆; O型口蹄疫多肽疫苗

口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus， FMDV）感染引起的偶蹄动物共患的急性、烈性、高度接触性传染病，属于微小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）、口疮病毒属（Aphthovirus），有 A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3 以及 Asia1 型等7个血清型。合成肽疫苗的研究最早始于FMDV合成肽疫苗，FMDV O型多肽抗原是利用化学方法人工合成FMDV O型毒株VP1结构中141～160位的氨基酸序列，同时，在VP1上结合辅助T细胞表位的环状构造以增强疫苗的抗原性，克服了VP1环状多肽只有B细胞表位的缺点，借助内源性和外源性的Th位点，进一步加强了T细胞免疫，另外双硫键的存在提高了环状构造的稳定性[1-4]。

泊洛沙姆（poloxamer）是研究中最常用到的一种温度敏感性凝胶聚合物，由聚氧乙烯与聚氧丙烯按比例构成。它具有毒性低、刺激性小、生物相容性好及特殊的反向热胶凝性质，温度升高，疏水链聚氧丙烯段失水聚合成为胶束，这些球形胶束内核是聚氧丙烯，外壳是水合膨胀的聚氧乙烯链继续升温，胶束有序排列形成凝胶[5-9]。研究表明泊洛沙姆可以作为疫苗佐剂，能够显著提高疫苗免疫效力[10,11]。

淋巴细胞转化试验是体外检测T淋巴细胞功能的一种常用方法，可检查体内对应的迟发型变态反应以及计算在Con A刺激下转化成母细胞的数目，从而反映机体内的细胞免疫功能。MTT法的原理是活细胞内线粒体脱氢酶能将四氮唑盐（MTT）由黄色还原为蓝色甲臜，DMSO可溶解后者，活细胞数与甲臜成正比。酶标仪测定各孔吸光度值，判断细胞内线粒体氧化活性，间接反映细胞的增殖反应。

本研究通过MTT法检测泊洛沙姆作为FMDV O型多肽疫苗的佐剂对体外大鼠脾淋巴细胞增值的影响，来研究泊洛沙姆对疫苗免疫效力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 泊洛沙姆407（Poloxamer407）为德国BASF产品；FMDV O型多肽抗原液（7.06 mg/mL，用PBS稀释至50 μg/mL）、 FMDV O型油乳佐剂多肽疫苗（多肽浓度50 μg/mL） 购自上海申联生物有限公司。

1.1.2 主要试剂RPMI 1640培养液（(+) L-谷氨酸）为GIBCO公司产品，完全RPMI 1640培养液均另加20 mmol/L HEPES、1 mol/L 丙酮酸钠，10%小牛血清，pH调整至7.2，无菌滤膜过滤除菌；HEPES、四氮唑盐（MTT）（进口分装ST316）、伴刀豆蛋白A (Con A)、Hanks，H00811-0897，PAA laboratories GmbH Tris、二甲基亚砜(DMSO)（进口分装ST038）均购自碧云天生物技术研究所；无水乙醇，批号：20120508，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器 高压蒸汽灭菌锅：CL-40M，日本ALP公司；ESCO生物安全柜：AC2-4E1，Bio χ公司；倒置显微镜：Eclipse TS100，Nikon，Japan；高速冷冻离心机：Micro CL21R，Thermo electron corparation；涡旋混合器：Genie-2 (Scientific Industries Inc., Bohemia, NY, USA)；CO2培养箱：Nu.4750E, NUAIRE, U.S.A；酶标仪：Multiskan MK3型，Thermo Scientific, USA；96孔细胞培养板：美国Corning-Costar公司；细胞过滤器：70μm cell strainer （Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes， NJ USA）

1.1.4 实验动物 Wistar大鼠，32只，清洁级，3～4周龄，体重60～80 g，雌性，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲以标准饲料，自由饮水、采食，观察1周，健康正常大鼠用于实验。

1.2 方法

1.2.1 脾淋巴细胞混悬液的制备 大鼠处死后浸泡于75%酒精溶液中5 min，解剖盘中无菌操作，左腹侧中部开口分离脾脏结缔组织，取出脾脏，放入盛有5 mL Hanks液的培养皿中，用注射器芯于细胞过滤器中进行研磨使单个脾淋巴细胞通过网筛。将含有细胞的Hanks液转移至15 mL离心管中，4℃、250×g离心5 min；弃上清，细胞用Tris-NH4Cl冲洗，冰浴中3 min，250×g离心5 min；弃上清，完全RPMI 1640培养液冲洗细胞后250×g离心5 min；弃上清，完全RPMI 1640培养液悬浮细胞，将细胞悬液稀释10倍后计数，用完全RPMI 1640培养液调整细胞浓度6×106个/mL。

1.2.2 细胞培养及增殖作用检测 将1.2.1中调整好浓度的细胞加入96孔细胞培养板中，每孔100 μL，每个样品5个孔，37℃、5% CO2培养箱中培养4 h；取出样品板分为静息期细胞、ConA处理细胞、4组样品处理细胞组，每组加入100 μL样品，每个样品设5个浓度梯度，依次由低到高分别为原样品浓度的1/10、1/20、1/40、1/80，每个样品重复5次。 每个待测样品除静息期组外分别每孔加入Con A（终浓度为10 mg/L），继续培养64 h；培养结束前4 h取出培养板每孔加入20 μL MTT（终浓度为0.5 g/L），继续培养4 h；细胞培养板250×g离心3 min，每孔吸出100 μL上清后加DMSO 100 μL，震荡5 min，酶标仪测570 nm处吸光度值。

1.3 数据处理计算细胞增值率%=（待测组A-空白对照组A）/空白对照组A，结果采用Prism6.0软件对数据进行作图。

2 结果与讨论

结果发现，泊洛沙姆各浓度对脾细胞均有增殖作用，多肽疫苗在高浓度的时候对细胞有抑制作用，随着作用浓度的降低，又进而转为细胞增殖作用。增值率结果见表1及图1。由此可见，泊洛沙姆具有促进大鼠脾细胞增殖作用，但不具有浓度依赖性，证实其具有免疫增强作用，能够作为疫苗佐剂。但由于O型口蹄疫多肽在浓度高时具有细胞抑制作用，而低浓度又转为细胞增殖作用，说明多肽疫苗直接作用于大鼠脾细胞，存在一定的细胞毒性，但对这一定论还需要进一步研究。

表1 MTT法分析脾淋巴细胞增殖活性Table1 Spleen lymphocytes stimulated activity by MTT assay

图1 MTT法分析脾淋巴细胞增殖活性Table1 Analysis of spleen lymphocytes proliferative activity in Wistar rat by MTT assay after immunization

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ADJUVANT EFFECT OF POLOXAMER ON FOOT-AND-MOUTH DISEASE VIRUS TYPE O PEPTIDE VACCINE REGARDING IN VITRO PROLIFERATION OF RAT SPLEEN LYMPHOCYTES

WANG Xiao-yang, WANG Mi, ZHANG Ke-yu, XUE Fei-qun

(Key Laboratory of Veterinary Drug Safety Evaluation and Residues Research, Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The use of poloxamer as adjuvant of Foot-and-mouth disease virus (FMDV) type O peptide vaccine was studied using proliferation of rat spleen lymphocytes as a parameter.The MTT assay was used to detect the increase rates of rat spleen lymphocytes at different concentrations of Poloxamer 407 and FMDV type O peptide vaccine.The optimal proliferation of rat spleen lymphocytes was observed with poloxamer concentration at 50 μg/mL and FMDV type O polypeptide antigen liquid at 50 μg/mL.As compared with the blank control group, the use of poloxamer as adjuvant signifi cantly enhanced the lymphocyte proliferation.However, the negative effect on the lymphocyte proliferation was observed at high peptide concentration but turned to positive at lower concentration.

Lymphocytes proliferation; poloxamer; FMDV type O peptide vaccine

S852.4

B

1674-6422（2015）02-0074-04

2014-12-02

公益性行业(农业)专项经费(201303038)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2013JB11)

王霄旸，女，硕士，助理研究员，主要从事兽用药物制剂研究

薛飞群，E-mail：fqxue@shvri.ac.cn